一种从茶组织中提取总rna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于核糖核酸（RNA)技术领域，具体涉及一种专门针对茶树总RNA的提取 方法，适于于茶树高质量总RNA的提取应用。
【背景技术】
[0002] 茶是中国重要的饮食文化的组成部分。关于茶的分子研宄有助于对茶的品质改 良，可以促进和提高人民的生活质量。然而相对于其他作物例如水稻，关于茶的分子研宄 就相当落后。这种滞后，主要原因之一是茶的DNA和RNA提取困难，尤其是茶总RNA的提 取特别困难。由于茶树的种子和茶叶富含多糖、多酚、油脂等许多次生代谢物，严重影响了 从茶叶和茶种子中提取高质量总RNA。现有技术中所有对茶总RNA提取方法的报道均发现 茶总RNA很难提取。虽然有个别关于茶RNA的提取方法报道，但是未见任何对于所报道方 法后续的大量应用。据报道改良的CTAB法可以提取茶树的总RNA，需要的时间2-3小时 (Muoki，Pauletal. 2012)。有报道用trizol提取茶种子中的总RNA，但是产量很低（林 萍，曹永庆etal.2011;李娜娜，陆建良etal.2012;Zhou，Linetal.2013)。与此类似， 国外的报道显示trizol提取茶树中的RNA不行（Muoki,Pauletal. 2012)。由于使用中需 要反复更换离心管，并且往往需要大体积离心管，所以不管是CTAB还是trizol提取中都容 易导致污染和RNA的降解。相比之下，柱式提取茶总RNA的技术快速，无污染。但是目前还 没有利用柱式提取茶总RNA的技术。以前的报道中尝试过用柱式法提取茶总RNA，却未能成 功（Muoki,Pauletal. 2012)。
【发明内容】
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[0003] 本发明的目的在于针对现有技术存在的上述不足之处，提供一种快速稳定的茶树 高质量总RNA的提取方法。本发明采用多种商业柱式RNA提取试剂盒对中国的六个茶品种 的组织进行了总RNA提取方法的系统研宄。通过悉心钻研和反复调整，研发了一种用商业 柱式RNA提取试剂盒快速从茶组织中提取高质量总RNA的方法。本发明的方法可以短时间 内成功地提取了茶树的嫩叶，老叶和种子的高质量总RNA并且成功地应用于下一代的高通 量的转录组测序。
[0004] 为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
[0005] 一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，该方法包括试剂盒设备提取前处理， 提取步骤，质量检测。
[0006] 如所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其中所述的试剂盒设备提取 前处理包括：
[0007] 提取前将用到的所有离心管，药勺和研钵用0. 1 %DEPC纯净水浸泡12小时，铝泊 纸包裹灭菌和干燥；
[0008] 提取前用RNAaseZAP喷雾离心机、试验台、试管架、移液器，1分钟后用无菌纸巾拭 干。
[0009] 如所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其中所述的试剂盒设备提取 前处理过程中的操作人员需带口罩和一次性无粉手套，用RNAaseZAP喷雾手套并拭干，使 用中适时更换新手套。
[0010] 如所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其中所述的提取步骤如下：
[0011] 将茶树新鲜或者液氮冷冻的叶子、种子在完全预冷并装有液氮的研钵中迅速研成 粉末，将1. 5ml或2ml经液氮预冷过的自备离心管置于已预冷过的试管架上，将粉末迅速转 移至该离心管中，转移的量为0.2-0. 3ml/管，加入700ylSL，立即剧烈漩涡混匀，增加振 荡时间2-5min;
[0012] 将上一步的离心管至于离心机，12000rpm(~13,400Xg)离心2min后，取出置于 试管架；
[0013] 将离心以后的上清液倒入至过滤柱CS上，12000rpm(~13, 400Xg)离心2min，用 200y1移液器小心吸取收集管中的上清至新的1. 5ml自备离心管中；
[0014] 用200y1移液器缓缓加入0. 4倍上清体积的无水乙醇，立即盖紧管盖，上下颠倒 离心管，充分混匀，用1000y1移液器迅速将得到的溶液和沉淀一起转移到吸附柱CR3中， 将吸附柱CR3放回收集管中；12000rpm(~13,400Xg)离心15sec，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱CR3放回收集管中；
[0015]向吸附柱中加入 150-280y1 去蛋白液RW1，，放置 2min，12000rpm(~13, 400Xg) 离心15sec,倒掉收集管中废液，将吸附柱CR3放回收集管中；
[0016] 重复上一步骤1次；
[0017]DNaseI工作液的配制：取10y1DNaseI储存液放入新的RNase-Free离心管中， 加入70y1RDD溶液，轻轻混匀，向吸附柱CR3中央加入80y1DNaseI工作液，室温放置 15min；
[0018] 向吸附柱CR3中加入250-350y1去蛋白液RW1，12000rpm(~13, 400Xg)离心 15sec，倒掉收集管中废液，将吸附柱CR3放回收集管中；
[0019]向吸附柱CR3中加入500y1漂洗液RW(使用前检查是否已加入乙醇）， 12000rpm(~13, 400Xg)离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；
[0020] 重复上一步骤1次；
[0021] 12000rpm(~13, 400Xg)离心2min，将吸附柱CR3放入一个新的1.5ml自备离心 管中，向吸附膜中央部位悬空滴加50y1RNase-FreeddH20,室温放置2min，12000rpm(~ 13, 400Xg)离心lmin，得到RNA溶液，置于冰上待测或储藏于-20°冰箱暂存，长时间保存 需置于-80°冰箱。
[0022] 根据所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其中所述的研磨过程要保 证材料不能解冻，研磨后在转移前加入更多的液氮至粉末中使粉末保持冷冻，若茶树种子 在液氮中冷冻过后较为坚硬，此种情况可用研钵棒先将其砸碎为细小颗粒再行研磨。
[0023] 根据所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其中所述的试剂SL使用前 务必加入0 _巯基乙醇至终浓度5% -10% ;如不能及时加入SL，要将装有粉末的离心管置 于液氮中保存；若有多管材料，离心管要置于试管架。
[0024] 根据所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其中所述的过滤柱CS要放 在收集管中，收集上清至新的离心管时要尽量避免吸取上层油类及下层细胞碎片沉淀，并 记下转移的上清总体积的数值ul。
[0025] 按照所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其中所述的试剂RW1的体 积范围为150-280y1。
[0026] 按照所述的一种从茶组织中提取高质量总RNA的方法，其中所述的加ddH20的体 积和温度范围为：50ylRNase-FreeddH20,预先加热至40-50°C。
【附图说明】：
[0027] 图1.为碧香早茶芽叶Nanodrop检测RNA质量峰图；
[0028] 图2.为碧香早茶芽叶和种子RNA的琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】：
[0029] 下面结合附图，用本发明实施例来进一步说明本发明的实施方式，但并不以此来 限定本发明。
[0030] 实施例1
[0031] 提取碧香早芽叶和种子总RNA方法概述：
[0032] 发明的内容包括所需试剂盒设备，提取前专有处理过程，提取操作步骤和所提的 RNA质量检测四部分。具体实施方案如下：
[0033] 所需试剂和设备
[0034] RNAaseZAP，DEPC，无水乙醇，0 -巯基乙醇，液氮，
[0035] 离心管，试管架，药勺，研钵，灭菌锅，铝泊纸，无菌纸巾，200ul移液器，lOOOul移 液器，200ul带过滤器的枪头，1000ul带过滤器的枪头
[0036] 1.提取前专有处理过程
[0037] 1. 1提取前将用到的所有离心管，药勺和研钵用0. 1%DEPC纯净水浸泡12小时， 铝泊纸包裹灭菌和干燥。
[0038] 1. 2提取前用RNAaseZAP喷雾所用到设备离心机、试验台、试管架和移液器，等待1 分钟后用无菌纸巾拭干。提取中操作人员带口罩和一次性无粉手套，用RNAaseZAP喷雾手 套并拭干。
[0039] 2?提取步骤
[0040] 2. 1.将80-120mg茶树新鲜或者液氮冷冻的叶子、种子等组织材料在完全预冷并 装有液氮的研钵中迅速研成粉末，研磨过程保证材料不能解冻。研磨以后在转移前可以再 加入更多的液氮至粉末中使粉末保持冷冻（新加到研钵中的液氮一般可以坚持3-5分钟）。 茶树种子在液氮中冷冻过后较为坚硬，此种情况可用研钵棒先将其砸碎为细小颗粒再行研 磨。将1.5ml或2ml经液氮预冷过的自备离心管置于已预冷过的试管架上。用液氮冷冻的 药勺将粉末迅速转移至该1. 5ml或2ml离心管中，转移的量为0. 2-0. 3ml/管，加入700y1 SL(使用前务必加入0 -巯基乙醇至终浓度5% -10% )，立即剧烈漩涡混匀，可适当增加振 荡时间2-5min。如不能及时加入SL，将装有粉末的离心管置于液氮中保存。若有多管材料， 离心管可以暂时至于试管架。粉末转移的量为0. 2-0. 3ml/管，适用解决了用量无法在液氮 情况下称量的问题和保证了RNA产量。
[0041] 2. 2?将上一步的离心管至于离心机，12000rpm(~13, 400Xg)离心2min。离心以 后，将离心管取出至于试管架。
[0042] 2. 3.小心地将离心以后的上清液倒入至过滤柱CS上（过滤柱放在收集管中）， 12000rpm(~13, 400Xg)离心2min，用200y1移液器小心吸取收集管中的上清至新的 1. 5ml自备离心管中，尽量避免吸取上层油类及下层细胞碎片沉淀。记下转移的上清总体积 的数值（ul)。
[0043] 2. 4.用200y1移液器缓缓加入0. 4倍上清体积的无水乙醇，立即盖紧管盖，上下 颠倒离心管，充分混匀，用1000y1移液器迅速将得到的溶液和沉淀一起转移到吸附柱CR3 中，将吸附柱CR3放回收集管中。12000rpm(~13,400Xg)离心15sec,倒掉收集管中的废 液，将吸附柱CR3放回收集管中。若有多管材料，将收集管至于试管架。
[0044] 2. 5.向吸附柱中加入150-280y1去蛋白液RW1，，放置2min，12000rpm(~ 13,400Xg)离心15sec,倒掉收集管中废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
[0045] 2. 6?重复步骤2. 5-次。
[0046] 2. 7.DNaseI工作液的配制：取10ulDNaseI储存液放入新的RNase-Free离心 管中，加入70y1RDD溶液，轻轻混匀。向吸附柱CR3中央加入80ylDNaseI工作液，室温 放置15min。
[0047] 2.8.向吸附柱〇?3中加入250-350 111去蛋白液咖1，12000印111(~13,400\§)离 心15sec，倒掉收集管中废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
[0048] 2.9.向吸附柱CR3中加入500yl漂洗液RW(使用前检查是否已加入乙醇）， 12000rpm(~13, 400Xg)离心15sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
[0049] 2. 10?重复步骤