一种小麦基因组dna提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种植物基因组DNA提取方法，具体涉及一种小麦基因组DNA提取方 法。
【背景技术】
[0002] 随着分子生物学不断的发展，众多分子生物学实验的样本需求量都很大，简便快 捷高效稳定的DNA提取技术是从分子水平上推进小麦相关研宄发展的必要前提，也是研宄 效率的关键。小麦基因组的DNA提取一般须经过破碎细胞壁、裂解细胞膜、除去多糖和多 酚等次生物质、变性分离蛋白质、沉淀核酸、去除RNA和浓缩DNA等几个步骤。一般来说， CTAB(十六烷基三乙基溴化铵）法对处理含多糖成分的植物组织有独特的优势，广泛应用 于植物基因组DNA的提取，而SDS(十二烷基硫酸钠）法在植物基因组DNA的提取中应用较 少，主要应用于对模板DNA质量要求不太严的RAH)分析。但传统的CTAB法操作繁琐，试剂 消耗量大，并且使用器皿多，研磨器皿等需要重复利用，易造成样品污染，产率也较低。
[0003] 目前，关于植物DNA提取方法的报道绝大部分都是在SDS法和CTAB法基础上进行 改良，但都无法摆脱用研磨棒或玻璃棒对样品逐个研磨的操作步骤，且提取步骤繁琐耗时。 近年来也出现了植物DNA其他的简易提取方法，如高盐低pH值法、碱处理法、高温水煮法 等，虽然这些方法步骤简单、速度快、成本低，避免使用液氮、苯酚等试剂，但是往往存在着 DNA提取质量较差、一天能够提取300份样品左右，不能满足要求较高的PCR扩增等诸多问 题。因此，迫切需要建立一个快速经济高通量高质量的DNA提取方法，为PCR扩增、分子标 记辅助育种、基因定位和转基因植物检测等多种分子实验提供有效手段。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种简便、快速、高通量、高质量的小麦基因 组DNA提取方法。
[0005] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种小麦基因组DNA提取方法，将待 提取小麦材料样品分别置于96孔板中，接着在每孔中放入钢珠，开盖置于真空冷冻干燥器 中在-100~-120°C冷冻干燥20~28h，然后利用研磨仪对小麦材料样品进行研磨；最后采 用改良的SDS法利用排枪从研磨后的粉末中提取DNA。
[0006] 进一步，所述小麦材料为小麦种子播种发芽，第一片真叶展开后的新鲜真叶；所述 每孔待提取小麦材料样品的用量为50~100mg。
[0007] 进一步，所述新鲜真叶的长度为4~6cm。
[0008] 进一步，所述96孔板为96孔联体试管板，使用96孔联体试管板，而不是单个离心 试管，对叶片进行冷冻干燥后粉碎，无需使用液氮。
[0009] 进一步，每孔放入1个无水酒精清洗的钢珠，每个小试管中放入一个钢珠保证各 个样品单独研磨避免了其他方法研磨时出现研磨器具重复使用造成交叉污染的可能性。
[0010] 进一步，所述采用改良的SDS法利用排枪从研磨后的粉末中提取DNA的方法，包括 以下步骤：
[0011] (1)将研磨后的粉末样品在2~6°C，4000rpm，离心lOmin后，利用排枪向管中加 入SDS提取液，匀质化后，加入等体积酚、氯仿和异戊醇的混合液摇匀，其中酚：氯仿：异 戊醇的体积比为25 : 24 : 1，在-20°C冰箱冷冻lOmin后，接着在4°C环境中静置lOmin;
[0012] (2)取出样品称量配平，在2~6°C，4000rpm，离心20~25min，利用排枪自上往 下缓慢吸取上清液于96孔板中，并在96孔板中加入与上清液体积比为1 : 10的NaAc和 1 : 1的-20 °C预冷的异丙醇，盖上96孔盖子混匀，放入-20 °C冰柜冷冻30~50min，直至 DNA沉析出；
[0013] (3)将冷冻过的样品取出称量配平在2~6°C，4000rpm，离心lOmin后，打开96孔 盖子，迅速翻转96孔板倾倒管中的全部液体，将96孔板倒置在干燥的吸水纸上吸湿2~ 3次，将96孔板翻转朝上，加入与上清液等体积的75 %的酒精洗涤沉淀一次，在2~6°C， 4000rpm，离心5min，迅速倾倒全部清洗液，将96孔板倒置在干燥的吸水纸上吸湿2~3次， 将96孔板翻转朝上，加入与上清液等体积的无水乙醇洗绦沉淀一次，在2~6°C，4000rpm， 离心5min，迅速倾倒全部清洗液，将96孔板倒置在干燥的吸水纸上吸湿2~3次，将96孔 板翻转朝上，在超净工作台内干燥2~3h，加入与上清液等体积的TE或ddH20。
[0014] 本发明通过真空冷冻干燥后用研磨仪对组织叶片进行粉碎，1分钟能同时研磨出 192个样品，与传统液氮研磨相比，极大地解放了人力并提高了工作效率。同时冷冻离心机 一次能够离心4X96个即384个样品，通过使用96孔板及排枪，使得加样抽提效率大大提 高，同时，简化了SDS法提取DNA的步骤，只需加一次提取液抽提一次上清，其余步骤均为洗 涤除杂，一轮下来即完成一次384样品的DNA制备大概2小时；所提样品DNA依据其浓度 完全可供100次PCR的使用。实验证明，在小麦拔节期采样的叶片进行DNA提取同样能获 得质量较好的DNA，也能满足SSR、STS、SCAR等分子标记进行PCR扩增检测，并且成功将约 10000个F2代植株进行了分子标记筛选，将2000个转基因植株进行了检测。
【附图说明】
[0015] 图1为琼脂糖电泳检测基因组DNA。
[0016] 图2为WMC419标记在亲本及后代群体中的电泳图。
[0017] 图3为GWM11标记在亲本及后代群体中的电泳图。
[0018] 图4为WE173标记在亲本及后代群体中的电泳图。
[0019] 图5为小麦再生植株Bar基因的PCR结果。其中，3M:Marker;1:阳性对照；2:野 生型；3~23:阴性植株；黄色方框中为阳性植株。
[0020] 图6为小麦再生植株载体序列（含Bar和LTP)PCR结果。其中，M:Marker;1:阳 性对照；2:野生型；3~22:阳性植株。
[0021] 图7为小麦再生植株载体序列NW-22PCR结果。其中，M:Marker;1:野生型；2:阳 性对照；3~17:阴性植株；黄色方框中为阳性植株。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
[0023] 1、实验材料：小麦感病品种AvocetS和载体品种92R137以及两者杂交的F2代群 体（10000株左右）；小麦转基因材料西农1376和小偃22 (2000株左右）
[0024]2、主要仪器设备和耗材：冷冻干燥器（CoolSafeTM110-4L，丹麦）、研 磨仪（QIAGEN)、通风橱、离心机（eppendorf5810R)、紫外分光光度仪NanoDrop ND2000/2000C(ThermoSCIENTIFIC)、电泳仪（北京六一DYY-6)、凝胶成像系统（Bio-rad GelDoc)、96孔联体试管盒（武汉仪兴试验仪器设备厂）、96孔PCR板、排枪、钢珠等。
[0025]3、试剂：SDS提取液（DSbuffer)配方：0?lmol/LTris-HCl(pH8. 0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)，2%SDS(pH8.0) ;3mol/LNaAC(PH5.2);酚：氯仿：异戊醇（25 : 24 : 1); 异丙醇；乙醇（70% 和 95%) ;1XTE缓冲液（10mmol/LTris-HCl，lmmol/LEDTA，pH8.0);琼 脂糖（〇. 8%、1. 5% );丙烯酰胺凝胶（8% );溴化乙锭；硝酸银。
[0026] 实施例1
[0027] 1、DNA提取
[0028] (1)将两个F2代群体的种子播种发芽，待苗子高5cm，一般需要5~7天第一片真 叶展开后，取小麦幼叶5cm左右（干重约50mg)，将其分割成数段，按照对应次序放入八连排 管中（每个试管容量为lml)，每个96孔试管盒装有12排八连管。
[0029] (2)取样完毕后，用置珠器在每个试管放入1个事先用无水酒精清洗好的钢珠（直 径4mm)，然后将样品开盖放置真空冷冻干燥器中，-110°C干燥24h。
[0030] (3)取出试管盒，迅速盖上管盖和磨样盒盖，将试管盒固定于研磨仪上，注意保持 两侧平衡，进行研磨，一般25~30次/秒，1分钟左右，示样品而定。
[0031] (4)将磨好的样品需进行4°C，4000rpm，离心10min，以期粉状样品落入管底，然后 放置于_20°C冰箱中保存待提取DNA。
[0032] (5)样品离心后打开管盖，利用300ul排枪向管中加入220uLDSbuffer，匀质化 后，加入等体积（220uL)酚、氯仿和异戊醇的混合液，其中酚：氯仿：异戊醇的体积比为 25 : 24 : 1〇
[0033] (6)对应盖上盖子，用力摇匀后，振荡动作不宜太剧烈，否则可能会导致DNA断裂， 在-20°C冰箱冷冻10分钟后，再在4°C环境中静置10分钟。
[0034](7)取出样品并称量配平，4°C，4000rpm，离心20~25min。
[0035] (8)用排枪自上往下缓慢吸取上清100ul于96孔板（带帽）中，注意不要吸到分