专利名称：一种提取基因组脱氧核糖核酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取基因组脱氧核糖核酸的方法，属于生物中核酸应用技术领域。
背景技术：
在传统的基因分型、转基因检测、品系检测实验中，人们比较惯用的方法是，采用 手工抽提或者是购买一般的基因组脱氧核糖核酸(以下简称DNA)提取试剂盒进行。但是， 不管是采用手工抽提还是购买试剂盒进行提取，整个提取过程都要取一定量的材料，经过 液氮研磨一裂解液裂解一孵育一离心一有机抽提(或者过柱)一漂洗数次一晾干一溶解 (或者洗脱)这样的流程，最终得到DNA。而往往这些DNA仅仅是用作基因鉴定的聚合酶链 式反应(polymerase chain reaction,以下简称PCR)模板，用过一次后DNA便扔了 ，当然， 同时那些阴性的小老鼠们和那些阴性的拟南芥们，也扔了。也许这种操作得到的DNA纯度 和得率都是高的，但是即使不考虑使用液氮研磨时可能冻伤操作者的风险，整个提取过程 由于步骤繁琐，使用的仪器众多，等待时间很长。
发明内容
本发明的目的是提出一种提取基因组脱氧核糖核酸的方法，采用了特殊的技术， 旨在建立成熟稳定的、一步法直接从各种材料中提取DNA，用于各种基因的PCR检测体系。
本发明提出的提取基因组脱氧核糖核酸的方法，包括以下步骤
(1-1)将裂解缓冲液加入到植物组织、动物组织或细菌中的任何一种材料中，将材 料研碎，并涡旋混匀，得到第一混浊液，加入的质量体积比为植物材料、动物材料或细菌中
的任何一种裂解缓冲液=io毫克200微升； (1-2)在上述第一混浊液中加入质量体积比浓度为10-20毫克/毫升的蛋白酶K， 加入的体积为5-20微升，混匀，55-65。C下孵育5_30分钟，80-95。C加热3_10分钟，得到第 二混浊液； (1-3)对上述第二混浊液进行离心分离，离心转速为8000-13000转/分钟，离心时 间为3-5分钟，得到离心分离的上清液，上清液中含有脱氧核糖核酸。 上述方法中，裂解缓冲液的组成为pH值为8. 0、摩尔浓度为20-50毫摩尔/升的 三羟甲基氨基甲烷.盐酸，摩尔浓度为2. 0-4. 0毫摩尔/升的乙二胺四乙酸以及摩尔浓度 为20-50毫摩尔/升的氯化钠。 本发明提出的提取基因组脱氧核糖核酸的方法，其优点是 1、基因检测的首要条件是获得足够的DNA，所谓足够的DNA对其数量和质量的要 求并不需要太高，只要满足PCR条件即可。本发明方法提出了一步法直接提取DNA用于PCR 扩增，顾名思义采用一步法裂解材料，收获DNA，用于PCR扩增，操作简单快速，结果准确重 复性好。本方法的好处在于一步法提取DNA，即不用液氮研磨，不需要酶解和长时间孵育， 一次性裂解材料，材料范围广，植物组织、动物组织、细菌都适用，操作时间短，直接应用于基因检测等，具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可最大限度的减少人为误差。 2、直接PCR适用于对DNA的纯度和得率要求不是极高的实验，如基因检测等，操作 者只需一步将材料与裂解液混合，必要时将材料破碎，离心得到DNA，取1微升作为模板用 于20微升的PCR反应体系，便可确定目的基因的有无。比如在转基因筛选中，采用直接PCR 的方法，可瞬时得到DNA模板用于PCR鉴定，快速确定是否为转基因个体，不用花精力照顾 阴性的幼苗或幼体，节省了大量资源。此外，本发明方法还适用于品系检测、种子纯度检测 和分子标记等实验。 本发明提出了一步法、快速的DNA提取方法，用于PCR检测，快速、便捷、安全，效率 高、稳定性好，适合包括植物组织、种子、细菌和动物组织的PCR检测。
图1是对本发明实施例1获得的DNA进行泛素基因PCR扩增的检测结果。
图2是对本发明实施例2获得DNA进行凝集素基因PCR扩增的检测结果。
图3是对本发明实施例3获得DNA进行内参基因PCR扩增的检测结果。
图4是对本发明实施例4获得DNA进行通用引物PCR扩增的检测结果。
图5是对本发明实施例5获得DNA进行内参基因PCR扩增的检测结果。
具体实施例方式本发明提出的提取基因组脱氧核糖核酸的方法，包括以下步骤 (1-1)将裂解缓冲液加入到植物组织、动物组织或细菌中的任何一种材料中，将材 料研碎，并涡旋混匀，得到第一混浊液，加入的质量体积比为植物材料、动物材料或细菌中
的任何一种裂解缓冲液=io毫克200微升； (1-2)在上述第一混浊液中加入质量体积比浓度为10-20毫克/毫升的蛋白酶K， 加入的体积为5-20微升，混匀，55-65。C下孵育5_30分钟，80-95。C加热3_10分钟，得到第 二混浊液； (1-3)对上述第二混浊液进行离心分离，离心转速为8000-13000转/分钟，离心时 间为3-5分钟，得到离心分离的上清液，上清液中含有脱氧核糖核酸。 上述方法中，裂解缓冲液的组成为pH值为8. 0、摩尔浓度为20-50毫摩尔/升的 三羟甲基氨基甲烷.盐酸，摩尔浓度为2. 0-4. 0毫摩尔/升的乙二胺四乙酸以及摩尔浓度 为20-50毫摩尔/升的氯化钠。
以下是本发明方法的实施例 在实施例中所采用的一些试剂来源天根生化科技(北京)有限公司生产的2x PCRReagent、蛋白酶K，和灭菌水。
实施例1 : 1 、将200 iU裂解缓冲液加入到10mg拟南芥叶片中，将材料研碎，并涡旋混匀，得 到第一混浊液； 2、在上述第一混浊液中加入浓度为20mg/ml的蛋白酶K，加入的体积为10 y 1，混 匀，55t:下孵育10分钟，85t:加热5分钟，得到第二混浊液；
3、对上述第二混浊液进行离心分离，离心转速为13000转/分钟，离心时间为3分
钟，得到离心分离的上清液，上清液中含有脱氧核糖核酸。 实施例2 : 1 、将200 ill裂解缓冲液加入到10mg大豆叶片中，将材料研碎，并涡旋混匀，得到 第一混浊液； 2、在上述第一混浊液中加入浓度为20mg/ml的蛋白酶K，加入的体积为10iU，混 匀，55t:下孵育10分钟，85t:加热5分钟，得到第二混浊液； 3、对上述第二混浊液进行离心分离，离心转速为13000转/分钟，离心时间为3分
钟，得到离心分离的上清液，上清液中含有脱氧核糖核酸。 实施例3 : 1 、将200 iil裂解缓冲液加入到lOmg水稻叶片中，将材料研碎，并涡旋混匀，得到 第一混浊液； 2、在上述第一混浊液中加入质量体积比浓度为20mg/ml的蛋白酶K，加入的体积
为10iil，混匀，55t:下孵育10分钟，85t:加热5分钟，得到第二混浊液； 3、对上述第二混浊液进行离心分离，离心转速为13000转/分钟，离心时间为3分
钟，得到离心分离的上清液，上清液中含有脱氧核糖核酸。 实施例4 : 1 、将200 iU裂解缓冲液加入到800 y 1菌液收集的菌体中中，并涡旋混匀，得到第 一混浊液； 2、在上述第一混浊液中加入质量体积比浓度为20mg/ml的蛋白酶K，加入的体积
为10iil，混匀，55t:下孵育10分钟，85t:加热5分钟，得到第二混浊液； 3、对上述第二混浊液进行离心分离，离心转速为13000转/分钟，离心时间为3分
钟，得到离心分离的上清液，上清液中含有脱氧核糖核酸。 实施例5: 1 、将200 iil裂解缓冲液加入到lOmg小鼠组织中，将材料研碎，并涡旋混匀，得到 第一混浊液； 2、在上述第一混浊液中加入质量体积比浓度为20mg/ml的蛋白酶K，加入的体积
为10iil，混匀，55t:下孵育30分钟，85t:加热5分钟，得到第二混浊液； 3、对上述第二混浊液进行离心分离，离心转速为13000转/分钟，离心时间为3分
钟，得到离心分离的上清液，上清液中含有脱氧核糖核酸。 以下是对用本发明方法提取的DNA进行检测的实例 检测实例1 :对实施例1得到的DNA进行检测 以实施例1中得到的DNA为模板，拟南芥UBQ基因特异引物
,l-F 5 'CAGGACAAAGAGGGAATACC 3'，R 5' GTTGAACAGGAGGGATACC 3'，
圃2-F 5' ATGTTTTTCGATGGATACCA 3'，R 5' GATTGCGTTAGCAGGCTTTG 3'，圃3-F
5， ATGTTTTTCGATGGATACCA 3，， R 5， TCAACCCCTCAATGAATAC 3，进行258bp片段、1160bp片
段和1610bp片段的PCR扩增，PCR反应系为 2x PCR Reagent 10 ii 1 正向引物(10微摩尔每升，简称iiM) 0.5iU
5
反向引物(IO微摩尔每升，简称iiM) 0.5iU
模板DNA liil
灭菌水 补至20 ii 1 试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
PCR反应循环的设置
94°C 3min， 1循环 94°C 30秒(second,以下简称sec) ， 55°C 30sec， 72°C lmin 35循环;
72。C5min，l循环 结果检测反应结束后取8 1反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。电泳条件为用 0. 5XTBE电泳缓冲液配制2% (W/V)的琼脂糖凝胶，凝胶融化后加入含量为0. 5/ml的溴化 乙啶。按比例将8iU的PCR反应产物与上样缓冲液均匀混合，然后加入到凝胶孔中，以5V/ cm的电压进行电泳，电泳时间为40-60分钟。电泳结束后将凝胶置于凝胶成像仪上观察并 照相。 结果见图1 :点样顺序为1. DNA marker ;2、3. 258bp片段；4、5. 1160bp片段；6、 7. 1610bp片段。由图1可见，采用本发明方法提取的拟南芥叶片DNA，进行特异引物的PCR 扩增，得到的扩增片段与预期的扩增片段大小一致，所以用本方法提取的DNA完全能够满 足基因检测的要求。
检测实例2 :对实施例2得到的DNA进行检测 以实施例2中得到的DNA为模板，大豆lectin基因特异引物lectin-F : 5， GCCCTCTACTCCACCCCCATCC 3，，R :5' GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG 3， ， lectin_F5， ATGGCCA CCTCCAACTTCTCTA 3'，R 5'AGTTCACGTCAATGCCGAT 3'，进行118bp片段和6Q0bp片段的PCR
扩增，PCR反应系为 2x PCR Reagent 10 ii 1 正向引物(10iiM) 0.5 ill 反向引物(10iiM) 0.5 ill 模板DNA 1 ii 1 灭菌水 补至20 ii 1 试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
PCR反应循环的设置
94°C 3min， 1循环94°C 30秒(second,以下简称sec) ， 55°C 30sec， 72°C lmin 35循环;
72。C5min，l循环 结果检测反应结束后取8 1反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。电泳条件为用 0. 5XTBE电泳缓冲液配制2% (W/V)的琼脂糖凝胶，凝胶融化后加入含量为0. 5/ml的溴化 乙啶。按比例将8iU的PCR反应产物与上样缓冲液均匀混合，然后加入到凝胶孔中，以5V/ cm的电压进行电泳，电泳时间为40-60分钟。电泳结束后将凝胶置于凝胶成像仪上观察并 照相。 结果见图2，点样顺序为1. DNA Marker ;2、3. 118bp片段；4.阳性对照；5、 6.600bp片段；7.阳性对照。由图2可见，采用本发明方法提取的大豆叶片DNA，进行特异引物的PCR扩增，得到的扩增片段与阳性对照的扩增片段大小一致，所以用本方法提取的DNA 完全能够满足基因检测的要求。 检测实例3 :对实施例3得到的DNA进行检测以实施例3中得到的DNA为模板， 水稻内源基因引物F 5 'CGATGTCAAGCGTTACTCTA 3'，R 5 'AGGTGGTGGTGGCTCAATAT 3'禾口F 5 'CGATGTCAAGCGTTACTCTA 3，，R 5 'CAGACATTATCAGCTGGTAC 3，，进行272bp片段和694bp 片段的PCR扩增，PCR反应系为2x PCR Reagent10 ii 1正向引物(10iiM)0. 5ii 1反向引物(lOiiM)0. 5ii 1模板DNA1 ii 1灭菌水补至20 ii 1试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
PCR反应循环的设置94°C 3min， 1循环94°C 30秒(second,以下简称sec) ，55°C 30sec，72。C lmin 35循环;
72 °C 5min， 1循环结果检测反应结束后取8il1反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。电泳条件为用
0. 5XTBE电泳缓冲液配制2% (W/V)的琼脂糖凝胶，凝胶融化后加入含量为0. 5/ml的溴化 乙啶。按比例将8iU的PCR反应产物与上样缓冲液均匀混合，然后加入到凝胶孔中，以5V/ cm的电压进行电泳，电泳时间为40-60分钟。电泳结束后将凝胶置于凝胶成像仪上观察并 照相。 结果见图3，点样顺序为l.DNA Marker ;2、3.叶片DNA272bp片段；4、5.大米 DNA272bp片段；6.阳性对照；7、8.叶片DNA694bp片段；9、 10.大米DNA694bp片段；11.阳 性对照。由图3可见，采用本发明方法提取的水稻叶片DNA，进行特异引物的PCR扩增，得到 的扩增片段与阳性对照的扩增片段大小一致，所以用本方法提取的DNA完全能够满足基因 检测的要求。
检测实例4 :对实施例4得到的DNA进行检测 以实施例4中得到的DNA为模板，细菌通用引物16srDNA-F 5 'TAGCTGGTCTGAGAGGATGA 3'，R 5 'CTTGCCAGTATCAGATGCAGT，3进行297bp片段的PCR扩
增，PCR反应系为 2x PCR Reagent 10 ii 1 正向引物(IO微摩尔每升，简称iiM) 0.5iU
反向引物(IO微摩尔每升，简称iiM) 0.5iU
模板DNA 1 ii 1 灭菌水 补至20 ii 1 试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。 PCR反应循环的设置 94°C 3min， 1循环 94°C 30秒(second,以下简称sec) ， 55°C 30sec， 72°C lmin 35循环;
72。C5min，l循环 结果检测反应结束后取8 1反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。电泳条件为用 0. 5XTBE电泳缓冲液配制2% (W/V)的琼脂糖凝胶，凝胶融化后加入含量为0. 5/ml的溴化 乙啶。按比例将8iU的PCR反应产物与上样缓冲液均匀混合，然后加入到凝胶孔中，以5V/ cm的电压进行电泳，电泳时间为40-60分钟。电泳结束后将凝胶置于凝胶成像仪上观察并 照相。 结果见图4，点样顺序为1.DNA Marker ;2-5.阴性菌DNA扩增；6-9.阳性菌DNA 扩增。由图4可见，采用本发明方法提取的细菌DNA，进行特异引物的PCR扩增，得到的扩 增片段与预期的扩增片段大小一致，所以用本方法提取的DNA完全能够满足基因检测的要 求。检测实例5 :对实施例5得到的DNA进行检测以实施例5中得到的DNA为模 板，小鼠MILGFMAR2基因特异引物MILGFMAR2-F5， ATCCTCCTTCTATAGTCTGTCCAAGAGTAG3，， R5' CCTCCAGAAAAAGCTAGATACTAACCTT 3'进行332bp片段的PCR扩增，PCR反应系为
2x PCR Reagent 10 ii 1 正向引物(IO微摩尔每升，简称iiM) 0.5iU
反向引物(IO微摩尔每升，简称iiM) 0.5iU
模板DNA 灭菌水 补至20iU
试剂全部加好后，瞬时离心，将所有试剂收集到管底。
PCR反应循环的设置
94。C3min，l循环94°C 30秒(second,以下简称sec) ，55°C 30sec，72。C lmin 35循环;
72。C5min，l循环 结果检测反应结束后取8iU反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测。电泳条件为用
0. 5XTBE电泳缓冲液配制2% (W/V)的琼脂糖凝胶，凝胶融化后加入含量为0. 5/ml的溴化 乙啶。按比例将8iU的PCR反应产物与上样缓冲液均匀混合，然后加入到凝胶孔中，以5V/ cm的电压进行电泳，电泳时间为40-60分钟。电泳结束后将凝胶置于凝胶成像仪上观察并 照相。 结果见图5，点样顺序为1.DNA Marker ;2.阴性对照；3.阳性对照；4、5.小鼠肝 脏DNA扩增；6、7.小鼠心脏DNA扩增。由图5可见，采用本发明方法提取的小鼠组织DNA， 进行特异引物的PCR扩增，得到的扩增片段与阳性对照的扩增片段大小一致，而阴性对照 并无扩增，所以用本方法提取的DNA完全能够满足基因检测的要求。
8
权利要求
一种提取基因组脱氧核糖核酸的方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1-1)将裂解缓冲液加入到植物组织、动物组织或细菌中的任何一种材料中，将材料研碎，并涡旋混匀，得到第一混浊液，加入的质量体积比为植物材料、动物材料或细菌中的任何一种∶裂解缓冲液＝10毫克∶200微升；(1-2)在上述第一混浊液中加入质量体积比浓度为10-20毫克/毫升的蛋白酶K，加入的体积为5-20微升，混匀，55-65℃下孵育5-30分钟，80-95℃加热3-10分钟，得到第二混浊液；(1-3)对上述第二混浊液进行离心分离，离心转速为8000-13000转/分钟，离心时间为3-5分钟，得到离心分离的上清液，上清液中含有脱氧核糖核酸。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的裂解缓冲液的组成为pH值为 8. 0、摩尔浓度为20-50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷.盐酸，摩尔浓度为2. 0-4. 0毫摩 尔/升的乙二胺四乙酸以及摩尔浓度为20-50毫摩尔/升的氯化钠。
全文摘要
本发明涉及一种提取基因组脱氧核糖核酸的方法，属于生物中核酸应用技术领域。将裂解缓冲液加入到植物组织、动物组织或细菌中的任何一种材料中，将材料研碎，并涡旋混匀，得到第一混浊液，在其中加入蛋白酶K，混匀，孵育得到第二混浊液；对第二混浊液进行离心分离，得到离心分离的上清液，上清液中含有脱氧核糖核酸。本方法即不用液氮研磨，不需要酶解和长时间孵育，一次性裂解材料，材料范围广，植物组织、动物组织、细菌都适用，操作时间短，直接应用于基因检测等，具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可最大限度的减少人为误差。
文档编号C12N15/10GK101792756SQ201010129818
公开日2010年8月4日 申请日期2010年3月19日 优先权日2010年3月19日
发明者俞萍, 孙克非, 李晓晨, 柯海燕 申请人:天根生化科技(北京)有限公司