专利名称：逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及基因克隆、外源基因在原核细胞中的表 达、目的蛋白质的制备方法以及活性检测，特别是逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方 法以及活性检测。
背景技术：
(1)逆转肾纤维化治疗相关研究及存在的问题肾脏纤维化是不同病因(包括炎症、损伤、药物、糖尿病和遗传因素、衰老等)所导 致慢性肾脏疾病的最终共同结局。各种进展性肾脏疾病，无论其原发病如何，最终都将导致 肾脏纤维化，进展为终末期肾功能衰竭，并必须依靠透析或肾移植维持生命。因此，研究肾 脏纤维化的发病机制、探索能够缓解肾脏纤维化进程或逆转肾脏纤维化的有效治疗手段、 延缓终末期肾衰的发生是肾脏疾病研究领域亟待解决的重要临床问题。随着对肾脏纤维化发生的分子机制逐渐深入，发现转化生长因子 3 1 (Transforminggrowth factor-^ 1，TGF-3 1)禾口骨形态发生蛋白(bone morphorgenic protein, BMP)及其下游的smad信号转导通路在肾脏纤维化发生发展中起着决定性作用。 因此，通过阻断TGF-0 1信号转导通路和(或)增强BMP7信号来逆转或延缓肾脏纤维化 成为当前研究的热点，并已在大量的体外及动物实验中得以证实。然而，目前阻断TGF-3 1 信号转导通路多借助于基因治疗，因其需要载体介导，可控性差，转导效率有限，安全性低 等问题以及可能加重肾脏炎症反应而难以被临床所接受。而激活BMP7信号转导通路要求 BMP7使用剂量非常高，且重组BMP7价格昂贵，使得应用重组BMP7治疗肾脏纤维化也难以在 临床广泛使用。因此，开发一种新的能有效阻断TGF-0 1信号转导通路，且安全性高，毒副 作用小的蛋白药物，将为临床防治肾脏纤维化带来新的希望。(2)肾脏纤维化治疗的研究进展目前尚未有能够应用于临床的肾脏纤维化有效治疗手段。在临床前研究中阻断 TGF-0 1信号转导通路和激活BMP7信号转导通路却都能有效缓解肾脏纤维化并加速转归。①阻断TGF- 3 1信号转导通路缓解肾脏纤维化使用TGF-3 1 反义核酸、TGF-3 1 特异性小干扰 RNA(small interference RNA, siRNA)、II型TGF-0受体特异性siRNA和II型TGF-0受体胞外区均可在单侧输尿管梗 阻等模型动物抑制肾脏进行性间质纤维化。使用反义核酸封闭TGF-0 1下游产物CTGF表 达也可明显缓解肾脏纤维化。使用TGF-0 1受体ALK5抑制剂IN-1130治疗大鼠单侧输尿管梗阻肾脏纤维化模 型可显著降低TGF-0 lmRNA.I型胶原蛋白mRNA和磷酸化smad2蛋白水平、羟脯氨酸含量和 肾脏胶原蛋白总含量，并可下调a平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin, a-SMA)和 纤维连接蛋白表达，从而抑制肾脏纤维化进程。以上资料表明阻断TGF-3 1信号转导通路可以达到治疗、缓解肾脏纤维化的目 的。
然而反义核酸和siRNA在体内稳定性较差；可溶性受体胞外区空间结构复杂，必 须采用基因治疗手段给药；ALK5抑制剂IN-1130仅能抑制smad3磷酸化，不能高效阻断 TGF-0 1信号转导通路。还有研究显示TGF-0 1是个双刃箭，它另有较强的抗炎症和免疫调 节作用。使用TGF-0 1转基因小鼠制备梗阻性肾病和糖尿病性肾病模型发现肾脏炎症显著 减轻，其机制为TGF- 0 1通过上调smad7诱导I k B a表达并进一步阻断NF k B激活。深入 研究发现，过度表达smad7可抑制smad2/3激活，从而可以阻止TGF-0 1、血管紧张素II等 诱发胶原蛋白产生，并可在多种动物模型，包括梗阻性肾病和糖尿病性肾病显著缓解和抑 制肾脏纤维化的发生发展。根据这些研究结果我们不难看出目前已经建立的阻断TGF-3 1 信号转导通路的策略在抑制肾脏纤维化的同时也对机体对抗肾脏炎症的作用通路产生了 抑制作用，因此难于在临床推广应用。②BMP7在治疗肾脏纤维化中的应用1997年Vukicevic等人报道使用剂量250ug/kg的BMP7可显著减轻缺血再灌注诱 发的大鼠急性肾小管坏死并加速肾小管再生。2000年Hruska等发现使用剂量300ug/kg的 BMP7治疗单侧尿道完全梗阻所致梗阻性肾病大鼠模型，可明显抑制肾小管萎缩和间质纤维 化。2003年Zeisberg等发现使用剂量300ug/kg的BMP7治疗MRLlpr/lpr狼疮性肾炎小鼠 和C0L4A3-/-奥尔波特综合征小鼠也可显著抑制肾小管萎缩和间质纤维化，此后又发现相 同剂量的BMP7可显著加速急性肾小球肾炎小鼠模型肾小管间质性损伤回归。尽管BMP7在治疗急性和慢性肾脏疾病中都显示出良好的效果，然而BMP7的活性 形式为二聚体，含有6个分子内二硫键和一个分子间二硫键，使用基因工程技术制备时蛋 白复性成本过高，不能被广大患者接受。③SARA研究现状SARA最初是作为Smad2结合蛋白被发现，该蛋白通过两个FYVE锌指作用域定位于 早期内浆膜。SARA可与I型TGF- 0受体结合并可募集Smad2或Smad3至I型TGF- ^受体 进行磷酸化。Smad2和Smad3磷酸化后则被SARA释放，与Smad4装配形成Smad2/Smad4复合 物和Smad3/Smad4复合物，是肾脏纤维化的基础。进一步研究发现，位于SARA羧基末端的第 665-750aa 的 Smad 结合作用域(Smad-bindingdomain，SBD)在体外就能与 Smad2 和 Smad3 结合，并且SBD可与Smad2的MH2作用域共晶体化。SARA SBD中存在3个结构基序与Smad MH2的疏水沟结合，其选择性与单体形式的Smad结合并可在体外阻止Smad3/Smad4形成复 合物。最近研究证实，以大肠杆菌氧化还原蛋白A为支架，根据SBD序列构建的SARA肽适 体(p印tideaptamer)真核表达载体可显著抑制小鼠乳腺上皮细胞向间质细胞转分化。从 已有的研究结果来看，SARA是纤维化形成过程中TGF-0信号转导的负性调节分子。从以 上资料可以看出SARA肽适体是一个很有前景的肾脏纤维化预防和治疗药物。(3)蛋白转导功能域(protein transduction domain, PTD)研究现状蛋白转导技术是指利用蛋白转导功能域将与之共价结合的化合物、肽、核酸或与 之融合表达的全长蛋白质通过非受体依赖、非转运蛋白依赖、非能量依赖方式运送至细胞 内的一种技术。蛋白转导作用不是通过全长蛋白发生的，而是依赖于长约10 16个氨基 酸残基、富含碱性氨基酸残基、在生理PH值条件下带净正电荷的氨基酸序列，该序列即被 称为蛋白转导功能域。现已发现多种蛋白或多肽含有PTD，如HIV-1TAT、HSV-1 VP22以及果 蝇触角足同源蛋白(Drosophila Antennapedia homeoprotein, pANTP)等。最近研究表明PTD可显著提高药物进入细胞的效率，并已发展成为一种高效的细胞内药物转运技术。尽管 在临床前研究中阻断TGF-0 1信号转导通路和激活BMP7信号转导通路都能有效缓解肾脏 纤维化并加速转归，使用TGF-0 1信号转导通路阻断剂调节TGF-0 1和BMP7信号转导通路 之间的平衡成为治疗肾脏纤维化的重要手段。但目前阻断TGF-0 1信号转导通路的化学药 物或基因治疗方法，因安全性问题和加重肾脏炎症反应的可能性难以被临床所接受。而激 活BMP7信号转导通路要求BMP7使用剂量非常高，且价格昂贵，使得应用重组BMP7治疗肾 脏纤维化难以在临床广泛使用。目前尚未见有直接使用重组SARA肽适体预防和治疗肾脏纤维化的研究报道，所 以我们通过制备重组SARA肽适体并研究其对肾脏纤维化的治疗作用，探索能够替代BMP7 并能有效治疗、缓解肾脏纤维化的蛋白药物。该蛋白药物仅阻断TGF-0 1诱发的smad2/3 磷酸化，但对smad7的诱导作用没有影响，也就是说其能在不影响机体自身抑制肾脏炎症、 纤维化能力的同时阻断能够诱发肾脏纤维化的上游信号转导通路，因此在理论上用于治疗 肾脏纤维化时其临床疗效应显著高于目前已经建立的其它策略。鉴于SARA和smad2/smad3 间的相互作用发生于细胞内，SARA肽适体发挥其生物学活性的前提条件是高效进入细胞， 我们采用蛋白转导功能域与SARA肽适体融合表达，从而使融合蛋白PTD-SARA获得高效进 入细胞的能力。因此，通过建立融合蛋白PTD-SARA的基础上，并在细胞和大体动物实验证 明了融合蛋白PTD-SARA治疗肾脏纤维化的策略可行。
发明内容
本发明的目的之一在于应用TGF-3 1通路抑制蛋白SARA，将其与穿膜蛋白结构 域(PTD)融合在大肠杆菌中获得高效表达，提供一种逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备 方法以及活性检测，使其既具有新型TGF-0 1通路抑制SARA高效低毒的优点，又能有效的 穿过细胞膜和核膜，从而降低TGF-0 1通路抑制的临床用药量，提高量效比，增强其在逆转 肾脏纤维化治疗中的作用。本发明的目的之二 在于抑制TGF-3 1通路而逆转肾纤维化的新型穿膜融合蛋白 在抑制各种进展性肾脏疾病及肾功能衰竭治疗中的应用。本发明的技术方案是提供个一种逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及 活性检测，其特征在于它包括1)合成含酶切位点编码PTD-SARA的基因序列；2) PTD-SARA融合蛋白基因的克隆及构建；3)重组蛋白的诱导表达；4)重组蛋白的纯化；5)重组蛋白的体外穿膜活性检测；即重组PTD-SARA穿过HKC细胞胞膜和核膜的 能力；加入不同剂量的重组PTD-SARA，SARA和空白对照，检测其在细胞内胞浆和胞核中的
表达量；6)重组蛋白的体外生物学活性检测即重组PTD-SARA抑制TGF- ^ 1对人肾小管 上皮细胞HKC转分化的影响；加入不同剂量的重组PTD-SARA，再用TGF- ^ 1刺激HKC细胞， 观察细胞形态和表皮细胞标志物E-cadherin的表达以及间皮细胞标志物a -SMA表达量；7)重组蛋白的体内生物学活性检测按建立单侧输尿管结扎梗阻模型，以
6PTD-SARA为受试药物，SARA、注射用生理盐水为对照药物，以实验结束时肾脏纤维化为检 测指标，确定受试药物的逆转纤维化效果；以实验前后大鼠肾脏功能为检测指标，计算血液 BUN、SCr的含量及尿蛋白定量，确定受试药物的逆转肾脏功能的效果。
所述的重组蛋白的体外穿膜活性检测分别加入5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml剂量 的重组PTD-SARA，SARA和空白对照，免疫印迹检测细胞浆和胞核内PTD-SARA的表达量；浓 度为5ng/ml时，相对于内参PTD-SARA组、SARA组以及空白组细胞内SARA的表达分别为 0. 25，0. 17，0. 08 ；浓度为10ng/ml时，相对于内参PTD-SARA组、SARA组以及空白组细胞内 SARA的表达分别为0. 37，0. 23，0. 07 ；浓度为20ng/ml时，相对于内参PTD-SARA组、SARA组 以及空白组细胞内SARA的表达分别为0. 34，0. 25，0. 08 ；PTD-SARA组的穿膜效果显著高于 SARA组，10ng/ml是PTD-SARA作用的最佳浓度。 所述的分别加入5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml剂量的重组PTD-SARA，再用10ng/ ml的TGF-0 1刺激HKC细胞，此时观察表皮细胞标志物E-cadherin以及间皮细胞标志物 a -SMA ；空白对照组、SARA组和PTD-SARA组为5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml ；相对于内参表 皮细胞标志物E-cadherin的表达量分别为0. 08，0. 26，0. 45，0. 56，0. 54 ；间皮细胞标志物 a -SMA 的表达量分别为 0. 4,0. 31，0. 13，0. 08，0. 10。所述的重组蛋白的体内生物学活性检测，按建立单侧输尿管结扎梗阻模型，以 PTD-SARA为受试药物，SARA、注射用生理盐水为对照药物，以实验结束时肾脏纤维化为检 测指标，确定受试药物的逆转纤维化效果；以实验前后大鼠肾脏功能为检测指标，计算血液 BUN、SCr的含量及尿蛋白定量，确定受试药物的逆转肾脏功能的效果。所述的重组蛋白的纯化，按lg菌体加7ml裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，4°C搅 拌均勻后，用0. 2mg/ml溶菌酶裂解菌体，12000rpm，离心20min，收集上清，加固体硫酸铵至 45%饱和度，4°C静置lh，12000rpm，离心15min，收集上清；再加固体硫酸铵至65%饱和度， 4°C静置 lh，12000rpm，离心 15min，收集沉淀；用 60倍体积的 A液20mM PB pH6. 5，ImM EDTA 透析15小时，中间换液四次；透析后的上清用A液充分平衡的Q-S印harose Fast Flow层 析纯化，洗脱B液为0. 2丽aCl，20mM PB pH6. 5，ImM EDTA,连续梯度洗脱10个柱床体积，收 集各个洗脱峰，测定活性；取活性峰对50倍体积的C液20mM Tris CITris CI pH8. 5透 析过夜，中间换液三到四次；透析后上清用C液充分平衡的SP-s印harose Fast Flow层析 纯化，洗脱D液为20mM Tris -CI pH8. 5，1M NaCl，连续梯度洗脱4_5个柱床体积，收集洗脱 峰，进行活性测定和电泳检测。所述的新型穿膜融合蛋白，将TGF-0 1通路阻滞剂SARA与新型蛋白穿膜结构域 融合在大肠杆菌中获得高效表达，其基因的序列如下GGATCCTAT GCT CGT GCC GCA GCG CGG CAA GCT CGT GCT GGT CGG AAGTGG TGG CGG AAG TGG TGG CGG AAG TAT GAG CGC GGC CAG AGC CCG AACCCG AAC AAC CCG GCG GAA TAT TGC AGC ACC ATT CCG CCG CTG CAG CAGGCG CAG GCG AGC GGC GCG CTG AGC AGC CCG CCG CCG ACC GTG ATG GTGCCG GTG GGC GTG CTG AAA CAT CCG GGC GCG GAA GTG GCG CAG CCG CGTTAG GTCGAC。所述的将PTD-SARA融合蛋白基因的克隆至pQE30质粒，它的克隆位点是BamH I 和Sail ；将合成的片断于93°C变性lOmin，退火，再与用BamH I和Sail处理过的pQE30连接。
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所述抑制TGF-0 1通路而逆转肾纤维化的新型穿膜融合蛋白在抑制各种进展性 肾脏疾病及肾功能衰竭治疗中的应用。本发明的特点是由于将TGF-M通路抑制蛋白SARA与穿膜蛋白结构域(PTD)融 合在大肠杆菌中获得高效表达，利用硫酸铵盐析和阴阳离子交换的方法对目的蛋白进行纯 化，再将得到的目的蛋白进行了活性测试。制备出特异性抑制TGF-0 1通路而逆转肾纤维 化的新型融合蛋白，其既具有新型TGF-0 1通路抑制SARA高效低毒的优点，又能有效的穿 过细胞膜和核膜，从而降低TGF-0 1通路抑制的临床用药量，增强其在逆转肾脏纤维化治 疗中的作用。
图1是实施例重组蛋白PTD-SARA穿过细胞膜的结果图；图2是实施例重组蛋白PTD-SARA体外逆转TGF- β1诱导的HKC细胞转分化结果 图。图3是实施例重组蛋白PTD-SARA体内逆转纤维化结果图。
具体实施例方式以下结合实施例附图对本发明作进一步的详细描述。需要说明的是，下述实施例 仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施新的抑制TGF-0 1通路而逆转肾纤维化的新型穿膜融合蛋白的全序列测定， PGE-PTD-SARA测序结果为GGATCC TAT GCT CGT GCC GCA GCG CGG CAA GCT CGT GCT GGT CGG AAGTGG TGG CGG AAG TGG TGG CGG AAG TAT GAG CGC GGC CAG AGC CCG AACCCG AAC AAC CCG GCG GAA TAT TGC AGC ACC ATT CCG CCG CTG CAG CAGGCG CAG GCG AGC GGC GCG CTG AGC AGC CCG CCG CCG ACC GTG ATG GTGCCG GTG GGC GTG CTG AAA CAT CCG GGC GCG GAA GTG GCG CAG CCG CGTTAG GTCGAC制备如上所述的抑制TGF-β1通路而逆转肾纤维化的新型穿膜融合蛋白的方法 按以下步骤1)合成含有酶切位点的PTD-SARA ；2) PTD-SARA融合蛋白基因的克隆及构建；pGE30质粒由第四军医大学生物技术中心获得，它的克隆位点是Bam|| I和Sal I。按照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码PTD-SARA的核酸片断5' -GGATCC TAT GCT CGT GCC GCA GCG CGG CAA GCT CGT GCT GGT CGGAAG TGG TGG CGG AAG TGG TGG CGG AAG TAT GAG CGC GGC CAG AGC CCGAAC CCG AAC AAC CCG GCG GAA TAT TGC AGC ACC ATT CCG CCG CTG CAGCAG GCG CAG GCG AGC GGC GCG CTG AGC AGC CCG CCG CCG ACC GTG ATGGTG CCG GTG GGC GTG CTG AAA CAT CCG GGC GCG GAA GTG GCG CAG CCCCGT TAG GTCGAC-3 ‘将合成的片断于93°C变性lOmin，退火，再与用BamH I和Sal I处理过的pGE30连接。3)重组蛋白的诱导表达将重组好的质粒转化感受态大肠杆菌DH5 a细胞，随机挑选克隆，以BamH I和Sail双酶切鉴定，筛选；正确的克隆于LB中30°C活化振摇培养12小时后，次日以1 100 比例接种LB (含Amp 100 u g/ml)培养基，37°C继续培养至0D65(lnm = 0. 6时。3000rpm离心 15min收集菌体。经SDS-PAGE分析，发现诱导后在分子量大约10，OOODalton处有一条新生 蛋白带，用鼠抗人SARA抗体为一抗，酶标兔抗鼠IgG为二抗，进行Western blot分析，证实 了该新生蛋白带能够与抗SARA抗体发生特异性结合。4)重组蛋白的纯化按lg菌体加7ml裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，4°C搅拌均勻后，用溶菌酶 (0. 2mg/ml)裂解菌体，12000rpm，离心20min，收集上清，加固体硫酸铵至45 %饱和度，4°C 静置lh，12000rpm，离心15min，收集上清；再加固体硫酸铵至65 %饱和度，4°C静置lh， 12000rpm,离心15min,收集沉淀；用60倍体积的A液:20mMPB pH6. 5，ImM EDTA透析15小 时，中间换液四次；透析后的上清用A液充分平衡的Q-S印harose Fast Flow层析纯化，洗 脱B液为0. 2MNaCl,20mM PB pH6. 5，ImMEDTA,连续梯度洗脱10个柱床体积，收集各个洗脱 峰，测定活性。取活性峰对50倍体积的C液20mM Tris CI pH8. 5透析过夜，中间换液三到 四次；透析后上清用C液充分平衡的SP-s印harose Fast Flow层析纯化，洗脱D液为20mM Tris -ClpHS. 5，1M NaCl，连续梯度洗脱4_5个柱床体积，收集洗脱峰，进行活性测定和电泳 检测。SDS-PAGE凝胶电泳检测并经凝胶成像系统分析，纯度大于95%。4)重组蛋白的体外穿膜活性将处于对数生长期的HKC细胞以4000个细胞/孔接种于96孔培养板，贴壁生 长24小时后，弃去原培养液，加入用DMEM培养液配制好的含不同浓度本发明化合物的溶 液200 uL(PTD-SARA浓度分别为5ng/ml，10ng/ml和20ng/ml)，每个浓度设3个复孔，并设 SARA，和生理盐水对照。24小时后观察细胞内和细胞核内SARA的表达量。重组PTD-SARA穿膜活性结果显示分别加入5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml剂量的重 组PTD-SARA，SARA和空白对照，免疫印迹检测细胞浆和胞核内PTD-SARA的表达量。浓度为 5ng/ml时，PTD-SARA组、SARA组以及空白组细胞内SARA的表达分别为0. 25，0. 17，0. 08 (相 对于内参)。浓度为10ng/ml时，PTD-SARA组、SARA组以及空白组细胞内SARA的表达分别 为0. 37，0. 23，0. 07(相对于内参)。浓度为20ng/ml时，PTD-SARA组、SARA组以及空白组 细胞内SARA的表达分别为0. 34，0. 25，0. 08 (相对于内参)。10ng/ml是PTD-SARA作用的 最佳浓度。(如图1所示的PTD-SARA穿膜活性的检测)5)重组蛋白的体外抗纤维化作用重组PTD-SARA逆转TGF-0 1诱导的肾小管上皮细胞向间质细胞转分化将处于对 数生长期的HKC细胞以4000个细胞/孔接种于96孔培养板，贴壁生长24小时后，弃去原 培养液，加入用DMEM培养液配制好的含不同浓度本发明化合物的溶液200 y L，每个浓度设 3个复孔，并设SARA，生理盐水对照。使用lOng/ml的TGF-0 1诱导其向间质细胞转分化， 不同时间点观察PTD-SARA、SARA和生理盐水对上皮细胞向间质细胞转分化的抑制作用。观 测指标包括使用Western blot测定E-cadherin和a -SMA,使用HE染色观察细胞形态学 改变。重组PTD-SARA抑制TGF- ^ 1对人肾小管上皮细胞(HKC)转分化的结果显示空白 对照组、SARA 组和 PTD-SARA 组(5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml)表皮细胞标志物 E-cadherin 的 表达量分别为:0.08，0. 26，0.45，0.56，0.54(相对于内参)；间皮细胞标志物a-SMA的表达量分别为0. 4，0. 31，0. 13,0. 08,0. 10。PTD-SARA和SARA7均能在体外逆转TGF-3 1诱导 的转分化，PTD-SARA显著优于SARA的逆转效果，10ng/ml是PTD-SARA作用的最佳浓度(如 图2所示的PTD-SARA体外抗转分化作用(*p < 0. 05 ；< 0. 01))6)重组蛋白PTD-SARA的体内抗纤维化作用图3是实施例重组蛋白PTD-SARA体内逆转纤维化结果图(即PTD-SARA治疗对肾 脏纤维化和肾脏功能的影响(*p < 0. 05 ；**p < 0. 01)图)重组PTD-SARA对单侧输尿管梗阻所致肾脏纤维化模型的治疗作用制备小鼠UUO 模型，按300mg/kg体重尾静脉注射PTD-SARA，观察PTD-SARA对UUO模型肾脏纤维化的治 疗作用。设立假手术组、单纯UUO模型组和SARA组作为对照。组织形态学指标观察计算 机图象半定量分析肾脏间质胶原面积计算胶原面积比(％)、肾小管间质损伤计算肾小管 间质损伤指数，免疫组化染色定量肾组织FN、I-IV胶原蛋白、层粘连蛋白LN、TGF-0 1蛋白 等。肾脏功能学指标测定各时间点血液BUN、SCr的含量及尿蛋白定量。试验结果如表1 所示表1PTD-SARA治疗对肾脏纤维化和肾脏功能的影响 本发明抑制TGF-0 1通路而逆转肾纤维化的新型穿膜融合蛋白可作为在抑制各 种进展性肾脏疾病及肾功能衰竭研究和治疗中的应用。
权利要求
逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测，其特征在于它包括1)合成含酶切位点编码PTD-SARA的基因序列；2)PTD-SARA融合蛋白基因的克隆及构建；3)重组蛋白的诱导表达；4)重组蛋白的纯化；5)重组蛋白的体外穿膜活性检测；即重组PTD-SARA穿过HKC细胞胞膜和核膜的能力；加入不同剂量的重组PTD-SARA，SARA和空白对照，检测其在细胞内胞浆和胞核中的表达量；6)重组蛋白的体外生物学活性检测即重组PTD-SARA抑制TGF-β1对人肾小管上皮细胞HKC转分化的影响；加入不同剂量的重组PTD-SARA，再用TGF-β1刺激HKC细胞，观察细胞形态和表皮细胞标志物E-cadherin的表达以及间皮细胞标志物α-SMA表达量；7)重组蛋白的体内生物学活性检测按建立单侧输尿管结扎梗阻模型，以PTD-SARA为受试药物，SARA、注射用生理盐水为对照药物，以实验结束时肾脏纤维化为检测指标，确定受试药物的逆转纤维化效果；以实验前后大鼠肾脏功能为检测指标，计算血液BUN、SCr的含量及尿蛋白定量，确定受试药物的逆转肾脏功能的效果。
2.根据权利要求1所述的逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测，其 特征在于所述的重组蛋白的体外穿膜活性检测；分别加入5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml剂量 的重组PTD-SARA，SARA和空白对照，免疫印迹检测细胞浆和胞核内PTD-SARA的表达量；浓 度为5ng/ml时，相对于内参PTD-SARA组、SARA组以及空白组细胞内SARA的表达分别为 0. 25,0. 17,0. 08 ；浓度为10ng/ml时，相对于内参PTD-SARA组、SARA组以及空白组细胞内 SARA的表达分别为0. 37，0. 23，0. 07 ；浓度为20ng/ml时，相对于内参PTD-SARA组、SARA组 以及空白组细胞内SARA的表达分别为0. 34，0. 25，0. 08 ；PTD-SARA组的穿膜效果显著高于 SARA组，10ng/ml是PTD-SARA作用的最佳浓度。
3.根据权利要求1所述的逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测， 其特征在于所述的分别加入5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml剂量的重组PTD-SARA，再用10ng/ ml的TGF-0 1刺激HKC细胞，此时观察表皮细胞标志物E-cadherin以及间皮细胞标志物 a -SMA ；空白对照组、SARA组和PTD-SARA组为5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml ；相对于内参表 皮细胞标志物E-cadherin的表达量分别为0. 08，0. 26，0. 45，0. 56，0. 54 ；间皮细胞标志物 a -SMA 的表达量分别为 0. 4,0. 31，0. 13，0. 08，0. 10。
4.根据权利要求1所述的逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测， 其特征在于所述的重组蛋白的体内生物学活性检测，按建立单侧输尿管结扎梗阻模型，以 PTD-SARA为受试药物，SARA、注射用生理盐水为对照药物，以实验结束时肾脏纤维化为检 测指标，确定受试药物的逆转纤维化效果；以实验前后大鼠肾脏功能为检测指标，计算血液 BUN、SCr的含量及尿蛋白定量，确定受试药物的逆转肾脏功能的效果。
5.根据权利要求1所述的逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测，其 特征在于所述的重组蛋白的纯化，按lg菌体加7ml裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，4°C搅 拌均勻后，用0. 2mg/ml溶菌酶裂解菌体，12000rpm，离心20min，收集上清，加固体硫酸铵至 45%饱和度，4°C静置lh，12000rpm，离心15min，收集上清；再加固体硫酸铵至65%饱和度， 4°C静置 lh，12000rpm，离心 15min，收集沉淀；用 60倍体积的 A液20mM PB pH6. 5,lmM EDTA2透析15小时，中间换液四次；透析后的上清用A液充分平衡的Q-S印harose Fast Flow层 析纯化，洗脱B液为0. 2丽aCl，20mM PB pH6. 5，ImM EDTA，连续梯度洗脱10个柱床体积，收 集各个洗脱峰，测定活性；取活性峰对50倍体积的C液20mM Tris CITris CI pH8. 5透 析过夜，中间换液三到四次；透析后上清用C液充分平衡的SP-s印harose Fast Flow层析 纯化，洗脱D液为20mM Tris CI pH8. 5，1M NaCl，连续梯度洗脱4_5个柱床体积，收集洗 脱峰，进行活性测定和电泳检测。
6.根据权利要求1所述的逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测，其 特征在于所述的新型穿膜融合蛋白，将TGF-0 1通路阻滞剂SARA与新型蛋白穿膜结构域 融合在大肠杆菌中获得高效表达，其基因的序列如下GGATCC TAT GCT CGT GCC GCA GCG CGG CAA GCT CGT GCT GGT CGG AAGTGG TGG CGG AAG TGG TGG CGG AAG TAT GAG CGC GGC CAG AGC CCG AACCCG AAC AAC CCG GCG GAA TAT TGC AGC ACC ATT CCG CCG CTG CAG CAGGCG CAG GCG AGC GGC GCG CTG AGC AGC CCG CCG CCG ACC GTG ATG GTGCCG GTG GGC GTG CTG AAA CAT CCG GGC GCG GAA GTG GCG CAG CCG CGTTAG GTCGAC。
7.根据权利要求1所述的逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测，其 特征在于所述的将PTD-SARA融合蛋白基因的克隆至PQE30质粒，它的克隆位点是BamH I 和Sail ；将合成的片断于93°C变性lOmin，退火，再与用BamH I和Sail处理过的pQE30连接。
8.根据权利要求1所述的逆转肾纤维化的新型融合蛋白的制备方法以及活性检测，其 特征在于所述抑制TGF-0 1通路而逆转肾纤维化的新型穿膜融合蛋白在抑制各种进展性 肾脏疾病及肾功能衰竭治疗中的应用。
全文摘要
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及基因克隆、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白质的纯化、抑制TGF-β1通路而逆转肾纤维化的新型穿膜融合蛋白，其特征在于应用TGF-β1通路抑制蛋白SARA，将其与穿膜蛋白结构域(PTD)融合在大肠杆菌中获得高效表达，利用硫酸铵盐析和阴阳离子交换的方法对目的蛋白进行纯化，将得到的目的蛋白进行了活性测试。其既具有新型TGF-β1通路抑制剂SARA高效低毒的优点，又能有效的穿过细胞膜和核膜，从而降低TGF-β1通路抑制剂的临床用药量，增强其在逆转肾脏纤维化治疗中的作用，可望获得临床治疗肾脏纤维化的新型多肽药。
文档编号C12Q1/02GK101851635SQ201010129278
公开日2010年10月6日 申请日期2010年2月19日 优先权日2010年2月19日
发明者刘晓渭, 加慧卫, 孙世仁, 宋扬, 张鹏, 朱军, 李曼, 杜锐, 王汉民, 许国双, 陈威, 黄晨 申请人:中国人民解放军第四军医大学