专利名称：从造礁石珊瑚中提取虫黄藻基因组dna的试剂盒及其方法
技术领域：
本发明涉及一种从造礁石珊瑚中提取虫黄藻基因组DNA的试剂盒及使用该试剂盒提取造礁石珊瑚共 生虫黄藻基因组DNA的方法。
背景技术：
珊瑚礁具有极高的生物多样性，全世界海洋生物中有25%生活在珊瑚礁，有"海洋绿洲"或"海洋热带 雨林"之称，其社会经济价值不可估量。珊瑚礁生态系统具有极丰富的生物资源，是渔业的繁殖基地，为 人类提供重要的食物和药物资源；海底的珊瑚礁，风景秀丽，更是有名的海底花园，是人们极好的潜水旅 游圣地。因此珊瑚礁的保护和可持续利用日益引起人们的关注，例如我国目前已经成立海南三亚珊瑚礁国 家自然保护区和广东徐闻珊瑚礁国家自然保护区，由科研人员或者海洋保护管理部门工作人员对珊瑚礁生 态系统进行定期的监测。由于全球变暖引起的珊瑚白化直接威胁珊瑚礁生态系统的生存和发展，其中与造 礁石珊瑚共生的虫黄藻的种类和多样性直接影响到宿主石珊瑚能否抵御外界环境的变化，因此珊瑚礁保护 区的常规监测不仅需要掌握造礁石珊瑚的群落种类变化，与其共生的虫黄藻的种类和多样性同样也需要监 测，由于培养虫黄藻的技术不成熟以及不同生命周期的虫黄藻形态学特征不完全一致，以及虫黄藻因长期 适应于共生关系的情形下常会失掉很多的外在特征，因此运用传统的形态学方法识别与造礁石珊瑚共生的 虫黄藻的种类和多样性有其局限性。考虑到监测人员(包括科研人员和海洋保护管理部门工作人员)能够 便捷及快速的进行监测，分子生物学技术的运用无疑是最恰当的手段。利用分子生物学技术对虫黄藻进行种类鉴定首先要能提取到高质量的虫黄藻基因组DNA。由于虫黄 藻共生于造礁石珊瑚体内，而造礁石珊瑚本身具有碳酸钙的骨骼，提取过程中碳酸钙盐会对基因组DNA 片段造成机械剪切，从而为提取高质量的虫黄藻基因组DNA增加了困难。而常规的酚/氯仿提取方法，由 于方法繁琐，并且具有有机溶剂的毒性，不适于常规检测的运用。因此需要研制一种简易的从造礁石珊瑚 中提取虫黄藻基因组DNA的方法，以满足珊瑚礁保护区常规监测任务的需要。发明内容本发明目的是提供一种能从造礁石珊瑚中快速、高效提取虫黄藻基因组DNA的试剂盒及使用该试剂 盒提取造礁石珊瑚共生虫黄藻基因组DNA的方法，用于解决珊瑚礁保护区常规监测中利用分子生物学技 术识别与造礁石珊瑚共生的虫黄藻的种类和多样性的监测任务，为珊瑚礁保护区的保护和管理提供技术支 持。本发明所提供的虫黄藻DNA提取试剂盒，包含有以下试剂(a) 试剂A:由pH8.0， 100-300mM的Tris-Boric溶液、10-100mM的EDTA溶液、质量浓度1-5%的SDS 溶液、50-200mM的NaCl溶液和蒸馏水按25: 10: 10: 2: 53的体积比混合而成；(b) 试剂B:为蛋白酶E，其浓度为5-15mg/ml;(c) 试剂C:为RNAaseA,其浓度为5-30mg/ml;(d) 试剂D:为过饱和NaCl溶液，含有5-7M的NaCl;(e) 试剂E..为DNA洗涤液，为体积浓度为60-80%的乙醇溶液；(f)试剂F:为DNA洗脱液，采用pH8.0,5-20mM的TE缓冲液。 本发明优选的试剂盒的配方如下(a) 试剂A:由pH8.0, 250mM的Tris-Boric溶液、50mM的EDTA溶液、质量浓度2%的SDS溶液、 100mM的NaCl溶液和蒸馏水按25: 10: 10: 2: 53的体积比混合而成；(b) 试剂B:为蛋白酶E，其浓度为10mg/ml;(c) 试剂C:为RNAaseA，其浓度为20mg/ml;(d) 试剂D:为过饱和NaCl溶液，含有？M的NaCl;(e) 试剂E:为DNA洗涤液，为体积浓度为75%的乙醇溶液；(f) 试剂F:为DNA洗脱液，采用pH8.0， 10mM的TE缓冲液。在本试剂盒里，试剂A在高温(55-65'C)下可裂解细胞，使蛋白变性、染色体离析。试剂B主要水解消 化蛋白质。试剂C则用于降解RNA，防止RNA对下游操作造成干扰。试剂D为过饱和NaCl溶液，在高 浓度NaCl低PH下，DNA可以与硅胶结合。试剂E用以淸洗掉DNA以外的成分，在一定浓度的乙醇存 在下，冲洗过程中，DNA不会溶失。试剂F提供低盐稳定PH环境，用以洗脱DNA。本发明的主要原理为是研磨的组织细胞用试剂A裂解后，加入试剂B以除去蛋白和多糖类杂质，试 剂C则用于降解RNA。试剂D提供一种在高盐低pH值环境，在这环境下DNA能与硅胶可逆结合，双 链的DNA分子被硅胶吸附后，以天然状态或部分变性状态存在，不能用洗脱RNA或碳水化合物等生物大 分于的溶剂试剂E将其洗脱，而试剂E只将其它成分洗脱。最后，经过水溶性缓冲液试剂F重新水化后， DNA就能从层析柱上定量回收。使用本发明的试剂盒，从造礁石珊瑚中提取虫黄藻基因组DNA的方法包括以下步骤(1) 样品处理取约10-30mg造礁石珊瑚，加入液氮充分研磨成粉末状，小心倒入2ml离心管。(2) 细胞裂解加入100-300ul试剂A， 10-30ul试剂B,以移液枪头搅匀，60'C水浴5-15小时，期 间振摇数次。然后加入2-6ul试剂C，轻柔摇匀，37'C水浴l-5小时。(3) 杂质沉淀加入100-300ul试剂D，轻柔摇匀，70。C水浴5-15分钟，然后加入100-300 ul无水乙醇。(4) DNA吸附将DNA吸附柱放置在离心管中，仔细将上清液全部吸入DNA吸附柱中，注意不要 吸到组织，6000-10000rpm，离心卜3分钟。(5) 杂质洗除弃离心管中的滤液，重新将DNA吸附柱放置在离心管中，加入试剂300-600ul E， 6000-10000rpm,离心1-3分钟，重复1-2次，然后将DNA吸附柱放置在离心管中，空管10000-13000rpm， 离心3-8分钟。(6) DNA洗脱将DNA吸附柱放置在新的离心管中，37"C吹干5-20分钟。在吸附柱中加入25-75ul 试剂F，放置1-5分钟，10000-15000rpm，离心1-8分钟，离心管中收集液体即为虫黄藻基因组DNA溶液， -2(TC保存。本发明的优点和积极效果在本发明中，根据虫黄藻和造礁石珊瑚特殊的共生关系以及组织构造，创 造了一种独特的从造礁石珊瑚中提取虫黄藻基因组DNA的方法。本发明有以下明显优点和积极效果① 提取方法快捷。该方法以及试剂盒可以在IO小时内从造礁石珊瑚内提取到虫黄藻基因组DNA，可以节省完成监测任务的时间。②提取过程不使用酚、氯仿，减少了对监测人员的身体伤害。③所获DNA完整， 产量高，包含的遗传信息全面。④操作简单，不需要特殊仪器，成本低，可以满足科研人员和保护区工作 人员监测任务的需要。
具体实施方式
下列实施例是进一步对本发明的说明，不应该当作对本发明的限制。 实施例一按以下配方制作虫黄藻基因组DNA提取试剂盒-试剂A:由pH8.0， 250mM的Tris-Boric溶液、50mM的EDTA溶液、质量浓度2%的SDS溶液、100mM 的NaCl溶液和蒸馏水按25: 10: 10: 2: 53的体积比混合而成；试剂B:为蛋白酶E，其浓度为10mg/ml;试剂C:为RNAaseA，其浓度为20mg/ml;试剂D:为过饱和NaCl溶液，含有7M的NaCh试剂E:为DNA洗漆液，为体积浓度为75%的乙醇溶液；试剂F:为DNA洗脱液，采用pH8.0， 10mM的TE缓冲液。DNA吸附柱硅胶柱。按以下程序进行操作以提取美丽鹿角珊瑚共生的虫黄藻基因组DNA:(1) 样品处理取约30mg美丽鹿角珊瑚，加入液氮充分研磨成粉末状，小心倒入2ml离心管；(2) 细胞裂解加入200ul试剂A， 20ul试剂B，以移液枪头搅匀，6(TC水浴5小时，期间振摇数 次。然后加入4ul试剂C,轻柔摇匀，37'C水浴2小时；(3) 杂质沉淀加入200ul试剂D，轻柔摇匀，7(TC水浴10分钟，然后加入200 ul无水乙醇；(4) DNA吸附将DNA吸附柱放置在离心管中，小心将上清液全部吸入DNA吸附柱中，注意不要 吸到组织，8000rpm，离心1分钟；(5) 杂质洗除弃离心管中的滤液，重新将DNA吸附柱放置在离心管中，加入试剂500ulE， 8000rpm， 离心l分钟，重复l-2次，然后将DNA吸附柱放置在离心管中，空管13000rpm，离心5分钟；(6) DNA洗脱将DNA吸附柱放置在新的离心管中，37'C吹干15分钟。在吸附柱中加入50ul试剂 F，放置3分钟，13000rpm，离心3分钟，离心管中收集液体即为美丽鹿角珊瑚共生的虫黄藻基因组DNA 溶液，-20匸保存；实施例二按以下配方制作虫黄藻基因组DNA提取试剂盒试剂A:由pH8.0, 100mM的Tris-Boric溶液、10mM的EDTA溶液、质量浓度1%的SDS溶液、50mM 的NaCl溶液和蒸馏水按25: 10: 10: 2: 53的体积比混合而成；试剂B:为蛋白酶E，其浓度为5mg/ml; 试剂C:为RNAaseA，其浓度为5mg/ml; 试剂D:为过饱和NaCl溶液，含有5M的NaCl; 试剂E:为DNA洗涤液，为体积浓度为60%的乙醇溶液； 试剂F:为DNA洗脱液，采用pH8.0， 5mM的TE缓冲液。 DNA吸附柱硅胶柱。按以下程序进行操作以提取粗糙菊花珊瑚共生的虫黄藻基因组DNA:(1) 样品处理取约10mg造礁石珊瑚，加入液氮充分研磨成粉末状，小心倒入2ml离心管；(2) 细胞裂解加入100ul试剂A， 10ul试剂B，以移液枪头搅匀，6(TC水浴5小时，期间振摇数 次。然后加入2ul试剂C，轻柔摇匀，37'C水浴1小时；(3) 杂质沉淀:加入100ul试剂D，轻柔摇匀，7(TC水浴5分钟，然后加入100 ul无水乙醇；(4) DNA吸附将DNA吸附柱放置在离心管中，仔细将上清液全部吸入DNA吸附柱中，注意不要 吸到组织，6000rpm，离心1分钟；(5) 杂质洗除弃滤液，重新将DNA吸附柱放置在离心管中，加入试剂300ulE， 6000rpm,离心1 分钟，重复l-2次，然后将DNA吸附柱放置在离心管中，空管10000rpm，离心3分钟；(6) DNA洗脱将DNA吸附柱放置在新的离心管中，37"C吹干5分钟。在吸附柱中加入25ul试剂 F,放置l分钟，10000卬m，离心1分钟，离心管中收集液体即为虫黄藻基因组DNA溶液，-20'C保存。实施例三按以下配方制作虫黄藻基因组DNA提取试剂盒(a) 试剂A:由pH8.0， 300mM的Tris-Boric溶液、100mM的EDTA溶液、质量浓度5%的SDS溶液、 200mM的NaCl溶液和蒸馏水按25: 10: 10: 2: 53的体积比混合而成；(b) 试剂B:为蛋白酶E，其浓度为15mg/mh(c) 试剂C:为RNAase A，其浓度为30mg/ml;(d) 试剂D:为过饱和NaCl溶液，含有7M的NaCh(e) 试剂E:为DNA洗涤液，为体积浓度为80%的乙醇溶液；(f) 试剂F:为DNA洗脱液，采用pH8.0， 20mM的TE缓冲液。 DNA吸附柱硅胶柱。按以下程序进行操作以提取粗糙菊花珊瑚共生的虫黄藻基因组DNA:(1) 样品处理取约30mg造礁石珊瑚，加入液氮充分研磨成粉末状，小心倒入2ml离心管；(2) 细胞裂解加入300ul试剂A, 30ul试剂B，以移液枪头搅匀，60'C水浴15小时，期间振摇 数次。然后加入6ul试剂C，轻柔摇匀，37'C水浴5小时；(3) 杂质沉淀加入300ul试剂D,轻柔摇匀，7(TC水浴15分钟，然后加入300 ul无水乙醇；(4) DNA吸附将DNA吸附柱放置在离心管中，仔细将上清液全部吸入DNA吸附柱中，注意不要 吸到组织，10000rpm，离心3分钟；(5) 杂质洗除弃滤液，重新将DNA吸附柱放置在离心管中，加入试剂600ulE， 10000rpm，离心 3分钟，重复l-2次，然后将DNA吸附柱放置在离心管中，空管13000rpm，离心8分钟；(6) DNA洗脱将DNA吸附柱放置在新的离心管中，37'C吹干20分钟。在吸附柱中加入75ul试剂 F，放置5分钟，15000rpm，离心8分钟，离心管中收集液体即为虫黄藻基因组DNA溶液，-20'C保存。
权利要求
1.从造礁石珊瑚中提取虫黄藻基因组DNA的试剂盒，包含有以下试剂(a)试剂A由pH8.0，100-300mM的Tris-Boric溶液、10-100mM的EDTA溶液、质量浓度1-5％的SDS溶液、50-200mM的NaCl溶液和蒸馏水按25∶10∶10∶2∶53的体积比混合而成；(b)试剂B为蛋白酶E，其浓度为5-15mg/ml；(c)试剂C为RNAase A，其浓度为5-30mg/ml；(d)试剂D为过饱和NaCl溶液，含有5-7M的NaCl；(e)试剂E为DNA洗涤液，为体积浓度为60-80％的乙醇溶液；(f)试剂F为DNA洗脱液，采用pH8.0，5-20mM的TE缓冲液。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于包含以下试剂(a) 试剂A:由pH8.0， 250mM的Tris-Boric溶液、50mM的EDTA溶液、质量浓度2%的SDS溶液、 100mM的NaCl溶液和蒸馏水按25: 10: 10: 2: 53的体积比混合而成；(b) 试剂B:为蛋白酶E，其浓度为10mg/ml;(c) 试剂C:为RNAase A,其浓度为20mg/ml;(d) 试剂D:为过饱和NaCl溶液，含有7M的NaCl;(e) 试剂E:为DNA洗涤液，为体积浓度为75%的乙醇溶液；(f) 试剂F:为DNA洗脱液，采用pH8.0,10mM的TE缓冲液。
3. —种使用要得要求1所述的试剂盒从造礁石珊瑚中提取虫黄藻基因组DNA的方法，包括以下步骤(1) 样品处理取约10-30mg造礁石珊瑚，加入液氮充分研磨成粉末状，小心倒入2ml离心管；(2) 细胞裂解加入100-300ul试剂A, 10-30ul试剂B,以移液枪头搅匀，60'C水浴5-15小时，期 间振摇数次，然后加入2-6ul试剂C,轻柔摇匀，37'C水浴l-5小时；(3) 杂质沉淀加入100-300ul试剂D，轻柔摇匀，7(TC水浴5-15分钟，然后加入100-300 ul无水乙醇；(4) DNA吸附将DNA吸附柱放置在离心管中，将上清液全部吸入DNA吸附柱中，6000-10000rpm， 离心1-3分钟；(5) 杂质洗除弃离心管中的滤液，重新将DNA吸附柱放置在离心管中，加入试剂300-600ul E, 6000-10000rpm，离心1-3分钟，重复1-2次，然后将DNA吸附柱放置在离心管中，空管10000-13000rpm， 离心3-8分钟；(6) DNA洗脱将DNA吸附柱放置在新的离心管中，37'C吹干5-20分钟，在吸附柱中加入25-75ul 试剂F，放置1-5分钟，10000-15000rpm，离心1-8分钟，离心管中收集液体即为虫黄藻基因组DNA溶液， -20'C保存。
全文摘要
本发明提供一种从造礁石珊瑚中提取虫黄藻基因组DNA的试剂盒及其方法。试剂盒包括试剂A(裂解液)、试剂B(蛋白酶E)、试剂C(RNAase A)、试剂D(过饱和NaCl溶液)、试剂E(DNA洗涤液)、试剂F(DNA洗脱液)。在本发明的方法中，首先用含SDS的裂解液裂解组织细胞，然后提供一个高盐低PH的环境，使溶液中蛋白质进一步变性，而DNA可以结合在硅胶柱上。最后在水溶性缓冲液中，DNA就能从层析柱上定量回收。采用本试剂盒及其提取方法，可以快速便捷从不同种类的造礁石珊瑚中提取虫黄藻的基因组DNA，所获得的DNA可以用于分子生态学、系统进化等研究，进而满足珊瑚礁自然保护区定期监测任务的需要。
文档编号C12N15/10GK101250521SQ20081002730
公开日2008年8月27日 申请日期2008年4月9日 优先权日2008年4月9日
发明者李元超, 董志军, 晖 黄, 黄良民 申请人:中国科学院南海海洋研究所