专利名称：活体珊瑚共生藻的制备方法
技术领域：
本发明涉及水生生物的活体采集领域，具体涉及一种活体珊瑚共生藻的制 备方法。
背景技术：
珊瑚礁生态系统的物质循环和能量流动快捷高速，生物多样性丰富，对于 调节、优化和维持热带海洋环境作用显著，具有重要的生态功能和应用意义。 但是，随着全球气候变化和近岸人类活动加剧，近岸珊瑚礁生态系统正遭遇前 所未有的挑战，只有对珊瑚礁生态系统有更深入的了解，对造礁石珊瑚开展深 入的研究才能更好的保护和维持健康的珊瑚礁生态系统。
珊瑚绚丽多彩的色泽一直是它吸引人目光的焦点所在，而珊瑚的体色取决 于其体内的共生植物一单细胞虫黄藻，这种以寄宿方式生存的藻类，我们称之 为"共生藻"，共生藻不但赋予珊瑚绚丽的色泽，而且它凭借光照、二氧化碳 等物质以及珊瑚体表在水中渗透吸收的所有可能物质(包括氨基乙酸、氨基 丙酸、白胺酸等氨基酸和硝酸盐)就可以提供充足的养分给珊瑚，更为重要的 是，它还能将珊瑚体内积聚的废物进行分解处理，所以，共生藻的作用对珊瑚 的生长存活是极其重要的。
目前导致珊瑚死亡的原因有很多，但是在珊瑚的白化过程中都伴随着共生 藻浓度的降低，即白化。引起珊瑚白化的原因有很多，比如全球气候变暖导致 的海水温度升高、海洋酸化、水体中高悬浮颗粒物、水体富营养化等。通过监 测珊瑚共生藻的浓度、珊瑚体内叶绿素含量能够很好的反映珊瑚的生理状态，而珊瑚共生藻分类鉴定需要借助于分子生物学的方法，其DNA的提取需要大 量纯净的共生藻样品，开展珊瑚共生藻离体培养和生理实验能够揭开珊瑚白化 过程中石珊瑚与共生藻共生关系解体的机理，而开展以上研究工作都离不开纯 净活体珊瑚共生藻样品，因此，获得大量实验用纯净活体珊瑚共生藻是开展石 珊瑚基础研究的前提，具有重要的意义。
巨大合叶珊瑚黏液的采集方法(CN 1792164A)指出珊瑚虫分泌的黏液覆 盖在珊瑚虫所形成的礁块表面，这层黏液是珊瑚抵抗病菌的第一道门户，因此， 在活体珊瑚共生藻制备过程中会掺杂大量珊瑚黏液，珊瑚黏液的存在使得所制 备的活体珊瑚共生藻不够纯净，对后期的研究工作带来困扰，如何有效去除珊 瑚黏液是能否获得纯净活体珊瑚共生藻的关键。
目前国内外的文献所提到的制备珊瑚共生藻的方法中均未对如何去除大 量珊瑚黏液进行介绍，如Fitt等(Fitt WK, McFarland FK, Warner ME, Chilcoat GC. Seasonal patterns of tissue biomass and densities of symbiotic dinoflagellates in reef corals and relation to coral bleaching. Limnol Oceanogr, 2000, 45(3), 2000, 677-685)研究了珊瑚体内共生藻浓度与珊瑚组织生物量的季节变化以及与珊 瑚白化的关系，但是实验方法中没有介绍如何去除共生藻洗出液中的大量黏 液，从而快速获取纯净共生藻样品。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可有效快速去除珊瑚黏 液，从珊瑚体中获得大量的纯净的活体珊瑚共生藻的方法。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的 本发明的活体珊瑚共生藻，其制备方法包括如下步骤(1) 从海底采集健康珊瑚；
(2) 高压冲洗上述珊瑚表面，并收集冲洗珊瑚所得洗出液；
(3) 将上述收集起来的洗出液采用直径为300 500um的尼龙网过滤，所 得滤液再用直径为40 80 U m的尼龙网过滤，过滤后将所得滤液再次用直径为 15~25um的尼龙网过滤；
(4) 将上述过滤后的滤液置于离心管中，进行多次离心，离心条件依次为 140~160g离心4 6分钟、300~400g离心8 12分钟、500~600g离心8 12分钟 和1000 1200g离心8 12分钟，每次离心后弃去上清液，最后一次离心后，管 底所得沉淀物即为活体珊瑚共生藻。
上述步骤(1)中，从海底所采集的健康珊瑚是珊瑚体生长正常，群体颜 色较为一致，没有出现任何发白现象的。
上述步骤(2)中，高压冲洗珊瑚，珊瑚的面积一般选择25 36cm2，这样 既方便操作且容易测量洗出液的体积；高压冲洗珊瑚可选择市售的各种冲洗 器，如美国洁碧(waterpik)冲洗器；高压冲洗珊瑚，直到珊瑚表面完全变白， 收集冲洗珊瑚后得到的洗出液。
上述步骤(2)中，高压冲洗珊瑚所用的冲洗液必须是海水，不能用淡水 代替，否则会造成共生藻的死亡，冲洗液需用过滤海水，如可将新鲜海水经过 0.45 u m微孔滤膜过滤，过滤所得的海水即可用来高压冲洗珊瑚。
上述步骤(3)和步骤(4)的目的主要是将冲洗珊瑚所得洗出液中的大量 黏液去除掉，从而获得纯净且有活力的共生藻。
正常的珊瑚共生藻的直径一般为3 10um，因此步骤(3)中采用3种孔 径的尼龙网，第一次采用直径为300-500ym的尼龙网过滤，从而去除掉洗出液中的大量黏液，然后再依次用直径为40-80 ix m和15~25 P m的尼龙网过滤， 从而去除掉洗出液中残留的黏液。这3种孔径尼龙网的搭配不但能够快速有效 地去除掉珊瑚分泌的大量黏液，而且可以让珊瑚共生藻顺利通过网孔；每次过 滤后，最好再用过滤海水(制备方法同上)冲洗下网孔，把黏附在网上的未顺 利通过网孔的共生藻再冲洗出来，和之前的滤液合并，进行下一步的过滤。
上述步骤(4)主要是将过滤后的液体(既经过三步过滤后不含有黏液的 洗出液)再进一步地离心分离，从而获得纯净的活体珊瑚共生藻，这里离心力 和离心时间的选择是个重点，因为离心力过大会导致共生藻体的破碎和死亡， 无法获得完整有活力的共生藻，而离心力过小则无法全部沉积过滤液中的共生 藻，造成后续测量珊瑚共生藻密度和叶绿素含量值变小，因此本发明经过摸索 发现采用先140 160g离心4 6分钟，再依次300~400g离心8~12分钟、 500 600g离心8 12分钟，1000 1200g离心8 12分钟，则可获得完整且纯净 的活体珊瑚共生藻。
上述步骤(4)中，140~160g离心4~6分钟、300 400g离心8 12分钟和 500 600g离心8 12分钟，这三步每次离心弃去上清液后，需要向管内沉淀中 加入过滤海水，充分摇匀后再进行下一步的离心，这样可更加有效地去掉黏附 在共生藻表面的珊瑚粘液，从而获得纯净的活体珊瑚共生藻。
本发明方法制备所得活体珊瑚共生藻可按后续实验要求的不同，分别对应 不同的方法进行保存，如若后续对制备所得珊瑚共生藻进行分子标记实验和叶
绿素含量测定，则需要将该珊瑚共生藻置于-2crc保存；若后续对珊瑚共生藻
进行浓度计数，则需要将该珊瑚共生藻用5%~10%的甲醛固定；还可以光照下 对该珊瑚共生藻进行离体培养和其他生理实验。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1. 本发明在高压冲洗珊瑚时采用过滤过的新鲜海水， 一方面不会堵塞冲洗 器的出口，造成机械损坏，另一方面则不会对珊瑚共生藻造成伤害，影响共生 藻的活力；
2. 本发明的方法可以快速获得纯净、完整且具有活力的珊瑚共生藻，其操 作步骤经过优化精简后，减少了操作过程中珊瑚共生藻量的损耗和活力的降
低；
3. 本发明的方法采用合理地过滤及离心条件，将珊瑚表面的大量黏液去除 掉，从而制备得到纯净的活体珊瑚共生藻，该共生藻可满足各种后续实验的材 料要求，如可以估算珊瑚共生藻浓度、叶绿素含量和进行分子生物学研究，还 可以在光照下进行离体培养，开展室内生理实验等。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发 明做任何限定。 实施例l
本实施例制备活体珊瑚共生藻的方法，其具体步骤如下
(1)从中科院南海海洋研究所热带海洋生物实验站附近海域珊瑚礁区3 m 水深处，采集美丽鹿角珊瑚^coraporam/〃^ora，截取长度8cm，面积28 cm2
(用铝钼纸覆盖其表面测量表面积)；取新鲜海水用0.45um微孔滤膜过滤， 过滤所得的海水即为过滤海水；
(2)冲洗液为上述过滤海水，用美国洁碧(waterpik)冲洗器冲洗珊瑚的 表面至全部变白，收集冲洗珊瑚后得到的洗出液；(3) 将上述收集起来的洗出液用直径为425um的尼龙网过滤，所得滤液 再用直径为53 u m的尼龙网过滤，得到的滤液再次用18 U m的尼龙网过滤， 三步过滤去除洗出液中的黏液，18um的尼龙网过滤所得的滤液经量筒测量后 为35ml;
(4) 将上述滤液35ml置于离心管中，150g离心4分钟，丢弃上面的液体， 加入50ml过滤海水，充分摇匀，350g离心8分钟，弃去液体，加入50ml过 滤海水，充分摇匀，550g离心8分钟，弃去液体，再次加入50ml过滤海水， 充分摇匀，1100g离心8分钟，离心后弃去液体，离心管底所得沉淀物即为本 实施例的活体珊瑚共生藻。
向上述制备所得活体珊瑚共生藻中加入45ml过滤海水和5ml甲醛，固定 样品，显微镜下取样10次计数，取均值测算珊瑚共生藻的密度为2.23X106个. cm. 0
实施例2
本实施例制备活体珊瑚共生藻的方法，其具体步骤如下
(1)从中科院南海海洋研究所热带海洋生物实验站附近海域珊瑚礁区2.5 m 水深采集鼻形鹿角珊瑚Awopora woswto，截取长度8cm，面积26 cm2 (用铝 铂纸覆盖其表面测量表面积)；取新鲜海水用0.45um微孔滤膜过滤，过滤所 得的海水即为过滤海水；
(2) 冲洗液为上述过滤海水，用美国洁碧(waterpik)冲洗器冲洗珊瑚的 表面至全部变白，收集冲洗珊瑚后得到的洗出液；
(3) 将上述收集起来的洗出液用直径为380"m的尼龙网过滤，所得滤液 再用直径为62 u m的尼龙网过滤，得到的滤液再次用23 u m的尼龙网过滤，三步过滤去除洗出液中的黏液，23 ii m的尼龙网过滤所得的滤液经量筒测量后 为32ml;
(4)将上述32ml滤液置于离心管中，150g离心6分钟，丢弃上面的液体， 加入50ml过滤海水，充分摇匀，320g离心12分钟，弃去液体，加入50ml过 滤海水，充分摇匀，540g离心12分钟，弃去液体，再次加入50ml过滤海水， 充分摇匀，1000g离心12分钟，离心后弃去液体，离心管底所得沉淀物即为 本实施例的活体珊瑚共生藻。
将本实施例制备所得活体珊瑚共生藻取少许过滤在孔径为0.45的滤膜上， 应用超便携式调制荧光仪Mini-PAM(Walz, Germany)测量离体共生藻的活力， 其最大光合作用效率(Fv/Fm)为0.6S，与在珊瑚体内共生藻活力无差异。
实施例3
本实施例制备活体珊瑚共生藻的方法，其具体步骤如下
(1)从三亚小东海海域珊瑚礁区6 m水深采集丛生盔形珊瑚(C^toc^ /as"'w/a^)，截取一块珊瑚，表面积32 cm2 (用铝铂纸覆盖其表面测量表面 积)；取新鲜海水用0.45ixm微孔滤膜过滤，过滤所得的海水即为过滤海水；
(2) 冲洗液为上述过滤海水，用美国洁碧(waterpik)冲洗器冲洗珊瑚的 表面至全部变白，收集冲洗珊瑚后得到的洗出液；
(3) 将上述收集起来的洗出液用直径为355 Pm的尼龙网过滤，所得滤液 再用直径为58 u m的尼龙网过滤，得到的滤液再次用25 u m的尼龙网过滤， 三步过滤去除洗出液中的黏液，25 ii m的尼龙网过滤所得的滤液经量筒测量后 为45ml;
(4) 将上述45ml滤液置于离心管中，160g离心5分钟，丢弃上面的液体，加入50ml过滤海水，充分摇匀，400g离心10分钟，弃去液体，加入50ml过 滤海水，充分摇匀，600g离心10分钟，弃去液体，再次加入50ml过滤海水， 充分摇匀，1200g离心10分钟，离心后弃去液体，离心管底所得沉淀物即为
本实施例的活体珊瑚共生藻。
将本实施例制备所得活体珊瑚共生藻置于-2(TC保存，待后续用于分子生
物学实验。
权利要求
1、一种活体珊瑚共生藻的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤(1)从海底采集健康珊瑚；(2)高压冲洗珊瑚表面，并收集冲洗珊瑚所得洗出液；(3)将上述洗出液依次用直径为300～500μm、40～80μm和15～25μm的尼龙网过滤；(4)将上述过滤后的滤液置于离心管中，进行多次离心，离心条件依次为140～160g离心4～6分钟、300～400g离心8～12分钟、500～600g离心8～12分钟和1000～1200g离心8～12分钟，每次离心后弃去上清液，最后一次离心后，管底所得沉淀物即为活体珊瑚共生藻。
2、 根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述高压冲 洗珊瑚的冲洗液为过滤海水。
3、 根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述多次离 心的每一次离心弃去上清液后，先向管中沉淀中加入过滤海水，充分摇匀后再 进行下一步的离心。
4、 根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述每次过 滤后先用过滤海水冲洗尼龙网，将冲洗所得液体合并滤液再进行下一步过滤。
5、 根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述高压冲 洗珊瑚，珊瑚的面积选择25 36cm2。
6、 根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述过滤海水为新鲜海 水经0.45 u m微孔滤膜过滤所得。
全文摘要
本发明公开一种活体珊瑚共生藻的制备方法，该方法是高压冲洗海底采集的健康珊瑚后，洗出液依次用直径为300～500μm、40～80μm和15～25μm的尼龙网过滤，所得滤液再140～160g离心4～6分钟、300～400g离心8～12分钟、500～600g离心8～12分钟和1000～1200g离心8～12分钟，离心所得管底沉淀物即为活体珊瑚共生藻。本发明采用过滤海水高压冲洗珊瑚，即不会堵塞冲洗器的出口，又不会影响共生藻的活力。本发明采用优化后的过滤及离心条件，即减少了操作过程中珊瑚共生藻量的损耗和活力的降低，又去除掉大量黏液，制备得到纯净的活体珊瑚共生藻，可满足计算共生藻浓度、叶绿素含量、开展分子生物学实验和光照下离体培养等后续实验的材料要求。
文档编号C12N1/12GK101538535SQ20091003885
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月21日 优先权日2009年4月21日
发明者丰 尤, 李秀保, 练健生, 雷新明, 晖 黄, 黄良民 申请人:中国科学院南海海洋研究所