专利名称：一种从血块中快速提取基因组dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种从血块中快速提取基因组DNA的方法。
背景技术：
人类疾病诊断及遗传学分析研究中能否获得高质量基因组DNA非常重要。在检验 科室中人基因组DNA—般是从抗凝血中提取的，而血清学检测后遗留的大量血块却没有被 利用。从抗凝血中提取DNA的主要的原因如下目前从抗凝血中提取DNA的技术非常成 熟；抗凝血不需要前期处理，并可以在1小时内完成提取。相应的，从血块中提取DNA存在如下问题方法繁琐、费时且效率低；需要繁琐的 前期处理(如用镊子或手术刀搅碎血块，不仅操作过程危险，还使操作人员直接接触血块； 用研磨器研磨血块需要认真清洗研磨物品，很容易造成交叉污染；用蛋白酶K消化血块一 般需要16小时以上)；从血块中提取DNA需要使用酚和氯仿等有机溶剂，不仅降低提取效 率，还危害操作人员的健康。
发明内容
本发明的目的是提供一种从血块中快速提取基因组DNA的方法。本发明提供的从血块中提取基因组DNA的方法，包括如下步骤(1)将血块在2-20牛顿压力下进行过滤，过滤孔径为40-130目，收集滤出液；(2)将滤出液与红细胞裂解液混勻后静置4-6分钟，然后9，000-13, OOOg离心 0. 5-1. 5分钟，取沉淀；(3)将沉淀与细胞裂解液混勻后63-67°C水浴8_12分钟，然后9，000-13, OOOg离 心0. 5-1. 5分钟，取上清；(4)将上清与异丙醇混勻后，用DNA结合柱进行纯化，得到基因组DNA。所述步骤⑴可为将血块在8-12牛顿压力下进行第一次过滤，过滤孔径为 40-60目，收集滤出液；然后将滤出液在8-12牛顿压力下进行第二次过滤，过滤孔径为 110-130目，收集滤出液。所述步骤(1)中，第一次过滤的过滤孔径具体可为50目，第二次 过滤的过滤孔径具体可为120目。所述步骤(2)中，具体可静置5分钟，然后10，OOOg离心1分钟；所述步骤(3)中， 具体可65°C水浴10分钟，然后10，OOOg离心1分钟。所述步骤(4)具体可为将步骤(3)得到的上清与异丙醇混勻后转移到DNA结合 柱，12，OOOg离心1分钟，弃流出液；然后在DNA结合柱中加入75% (体积百分含量)乙醇 水溶液，12，OOOg离心1分钟，弃流出液；然后在DNA结合柱中加入75% (体积百分含量) 乙醇水溶液，12000g离心1分钟，弃流出液；然后将DNA结合柱12，OOOg离心2分钟，弃流 出液；然后将DNA结合柱加入DNA溶解液，室温放置2分钟；然后将DNA结合柱12，OOOg离 心1分钟，收集流出液即为含有基因组DNA的溶液。
所述血块、所述红细胞裂解液、所述细胞裂解液、所述异丙醇的配比具体可为2mL 血块6mL红细胞裂解液lmL细胞裂解液250 μ L异丙醇。所述步骤(2)和步骤(3)之间还可包括如下步骤将步骤(2)得到的沉淀与红细 胞裂解液混勻后静置4-6分钟，然后9，000-13, OOOg离心0. 5-1. 5分钟，取沉淀。所述步骤 (2)和步骤(3)之间优选包括如下步骤将步骤(2)得到的沉淀与红细胞裂解液混勻后静 置5分钟，然后10，OOOg离心1分钟，取沉淀，所述红细胞裂解液的加入量与步骤(2)中红 细胞裂解液的加入量相同。所述红细胞裂解液可采用如下方法配制由NH4C1、KHCO3> Na2EDTA和水组成， pH7. 4 ；NH4Cl的浓度为155mM，KHCO3的浓度为10mM，Na2EDTA的浓度为0. ImM。红细胞裂解 液为常规配方，采用市售红细胞裂解液也可。所述细胞裂解液可采用如下方法配制由TriS-HCl、NaCl、Na2EDTA、SDS、蛋白酶K 和水组成，pH 8. 2 ；Tris-HCl的浓度为10mM，NaCl的浓度为400mM，Na2EDTA的浓度为2mM， SDS的浓度为(质量百分含量)，蛋白酶K的浓度为0. 5mg/mL。细胞裂解液为常规配方， 采用市售细胞裂解液也可。所述DNA溶解液具体可为pH7. 510mM的Tris-HCl水溶液(DNA溶解液为常规配方， 采用市售细胞裂解液也可)。所述DNA结合柱具体可为购自Generay公司，型号为GK0501的DNA结合柱。本发明还保护一种从血块中获得血液的方法，包括如下步骤将血块在8-12牛顿 压力下进行第一次过滤，过滤孔径为40-60目，收集滤出液；然后将滤出液在8-12牛顿压力 下进行第二次过滤，过滤孔径为110-130目，收集滤出液(血液)。第一次过滤的过滤孔径 具体可为50目，第二次过滤的过滤孔径具体可为120目。本发明的方法与传统方法相比具有以下优点(见表1)首先，DNA提取量和纯度都 有显著提高(P <0.05)；第二、大大简化纯化步骤，节省大量时间；第三、不使用任何有毒有 机溶剂，保证工作人员的健康安全；第四、均使用廉价一次性物品，在降低成本的同时，避免 潜在的交叉污染。表1本发明的方法与传统方法的比较 本发明提供的从血块中提取基因组DNA的方法通过微孔挤压过滤，在一分钟内有 效打散血块，并在不使用酚或氯仿等有毒有机溶剂的情况下，通过DNA纯化柱在一小时内 完成基因组DNA提取，具有快速、安全且高效的优点，适于推广应用。
图1为实施例1中部分DNA样本的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果；M =DNA marker ； 1-4 依次为样本1至4。图2为实施例1中部分DNA样本的PCR分析结果(TLR2基因，1. 3kb) ；M DNAmarker ； 1-4依次为样本1至4。图3为实施例1中部分DNA样本的SNP分析结果。
图4为实施例1中部分DNA样本的酶切分析结果；M1，M2 =DNA marker ；1，3，5，7依 次为样本1至4未酶切对照；2，4，6，8依次为样本1至4EcoRI酶切过夜。图5为实施例3中部分DNA样本的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果；M =DNA marker ；5-8 依次为样本1至4。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以 下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。 15份血块样本均来自于血清学检测后遗留的血块(每2mL血块由4mL血液凝结而 成)，用于实施例1至实施例3的均为该15份血块样本。实施例1、采用本发明的方法从血块中提取基因组DNA一、从血块中提取基因组DNA(一 )血块的快速打散1、将2mL血块放入垫有无菌纱布(50目孔径；40_60目孔径均可，可以根据血块的 情况选择)的一次性5mL注射器中，用8-12牛顿(2_20牛顿的力均可，可以根据血块的情 况选择施加力的大小)的力轻轻挤压。2、挤出来的血液样品移至另一个垫有无菌纱布(120目孔径；110-130目孔径均 可，可以根据血块的情况选择)的一次性5mL注射器中，用8-12牛顿(2_20牛顿的力均可， 可以根据血块的情况选择施加力的大小)牛顿的力轻轻挤压。3、收集流出血液至15mL离心管中。( 二 )提取血液DNA1、收集的血液中加入6mL红细胞裂解液，涡旋震荡混勻(约30秒)，室温放置5分 钟，然后10，OOOg离心1分钟，取沉淀，弃去红色上清。红细胞裂解液由NH4Cl、KHC03、Na2EDTA 和水组成，pH 7. 4 ；NH4Cl的浓度为155mM，KHCO3的浓度为10mM，Na2EDTA的浓度为0. ImM。2、沉淀中加入6mL红细胞裂解液，涡旋震荡混勻(约30秒)，室温放置5分钟，然 后10，OOOg离心1分钟，取沉淀。3、加入ImL细胞裂解液，涡旋震荡(充分打散白细胞)，置于65°C水浴10分钟(期间颠倒混勻2-3次)，然后10，OOOg离心1分钟，取上清。细胞裂解液由Tris-HCl, NaCl, Na2EDTA, SDS、蛋白酶K和水组成，pH 8. 2 ；Tris-HCl的浓度为10mM，NaCl的浓度为400mM， Na2EDTA的浓度为2mM，SDS的浓度为(质量百分含量)，蛋白酶K的浓度为0. 5mg/mL。4、将上清转移至新的1. 5mL离心管，并加入250 μ L异丙醇，涡旋震荡混勻(约10 秒)，然后用DNA结合柱(购自Generay公司，型号为GK0501，最大结合量30yg DNA)进行 纯化。纯化步骤按照DNA结合柱的说明进行，具体如下(根据预期的DNA含量，采用三个 DNA结合柱进行纯化，然后将纯和得到的DNA混合)将所有溶液平均转移到3个DNA结合 柱，12，OOOg离心1分钟，弃流出液；每个柱子加入700 μ L 75% (体积百分含量)乙醇水溶 液，12，OOOg离心1分钟，弃流出液；每个柱子加入500 μ L 75% (体积百分含量)乙醇水 溶液，12，OOOg离心1分钟，弃流出液；12，OOOg离心2分钟，弃去残留乙醇；每个柱子加入 100 μ L DNA溶解液(pH7. 510mM的Tris-HCl水溶液)，室温放置2分钟；12，OOOg离心1分 钟，收集流出液即为DNA样本(含有基因组DNA的溶液)。DNA样品保存于-20°C。 分别提取15份血块样品的基因组DNA。每份血块样本均在一小时内完成基因组 DNA的提取，得到15份DNA样本。二、提取效果鉴定1、提取量鉴定提取量=DNA样品中的DNA含量(μ g) +血块生成所用的血液的体积(4mL)。15份样本的平均DNA提取量为20. 1 士 4. 1 μ g/mL血液，平均OD值为1. 77 士 0. 11。2、琼脂糖凝胶电泳鉴定将步骤一提取的15份DNA样本分别进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳，均显示一条尖锐 的高分子量条带，表明纯度高，质量好。部分样本的电泳图见图1。3、PCR 分析针对TLR2基因中一段1. 3kb区域设计正向引物和反向引物如下正向引物5，-GTAGGTTGAAGCACTGGACAATG-3，反向引物5，-GACAAGTTTCAGGCATAGAATGAAAAC-3，。分别将步骤一提取的15份DNA样本进行PCR分析以IOOng DNA为模板，利用正 引物和反向引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR扩增步骤94°C 3分钟，(94°C 30 秒，58 0C 30 秒，72 0C 90 秒)X 35 循环，72 °C 10 分钟。将PCR扩增产物进行1. 2%琼脂糖凝胶电泳。电泳结果表明，均能有效扩增得到目 的条带，说明本方法提取的DNA适合于PCR分析。部分样本的电泳图见图2。4、SNP 分析为了进一步验证DNA质量，将步骤3的PCR扩增产物进行测序。15个DNA样本中， 7个样本的PCR产物的部分序列如序列表的序列1所示，6个样本的PCR产物的部分序列如 序列表的序列2所示，2个样本的PCR产物的部分序列如序列表的序列3所示。结果表明， 扩增的片段确实为目的片段(TLR2基因)，说明提取的DNA适合于测序。同时，测序结果中， 可以有效检测TLR2基因中SNP位点，说明提取的DNA适合于SNP分析。部分样本的部分区 域测序结果见图3。
5、酶切分析将步骤一提取的15份DNA样本分别进行酶切分析取2 μ g DNA，其中IygfflK 制性内切酶HindIII37°C酶切过夜，另外1 μ g作为对照不加任何酶37°C放置过夜；分别将 酶切后的样本和对照样本进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳。电泳结果表明，加入HindIII的基因组消化完全，而对照组DNA没有降解，说明本 方法提取的DNA可用于酶切及Southern blot分析。部分样本的电泳图见图4。实施例2、几种打散血块方法的比较一、采用本发明的方法打散血块同实施例1的步骤一。可以有效打散血块，得到均勻的血液。血液在室温放置20分钟依然稳定，不凝结。二、直接使用120目孔径纱布过滤打散血块将血块直接使用120目孔径纱布过滤。很难使血块通过纱布，需要施加非常大的压力，而且滤出的血液中含有小型血块 颗粒，不利于后续提取。三、离心过滤打散血块将血块通过离心的方法滤过无菌纱布(120目孔径)。在8，OOOg离心3分钟，血块可以完全滤过纱布，但离心结束时重新凝结在离心管 管底，严重影响后续提取。如果降低转速，血块无法有效滤过纱布。对比例、采用现有方法从血块中提取基因组DNA一、从血块中提取基因组DNA1、将2mL血块放入组织研磨器(经过彻底清洗并灭菌处理)中，研磨至没有明显 的血块组织。转移研磨后的样品至15mL离心管中。2、加入6mL红细胞裂解液，涡旋震荡混勻(约30秒)，室温放置5分钟，然后 10，OOOg离心1分钟，取沉淀，弃去红色上清。3、加入3mL细胞裂解液，涡旋震荡混勻，置于65°C水浴过夜处理；然后冷却至室 温，加入等体积酚/氯仿溶液(酚氯仿=1 1 ；体积比)，涡旋震荡(约30秒)，室温静 置5分钟；12，OOOg离心10分钟，将上清移至新的离心管。重复3-5次上述步骤，至蛋白不 再析出。4、加入等体积氯仿，涡旋震荡(约30秒)，室温静置5分钟；12，OOOg离心10分
钟，将上清移至新的离心管。5、加入2倍体积无水乙醇，上下颠倒混勻，室温放置10分钟，沉淀DNA ；12, OOOg 离心10分钟，弃上清；用75%乙醇清洗一次，8，OOOg离心5分钟，弃上清，室温晾干后用 300 μ L DNA溶解液溶解沉淀(DNA样品)。DNA样品保存于-20°C。分别提取15份血块样品的基因组DNA，得到15份DNA样本。二、提取效果鉴定1、提取量鉴定15份样本的平均DNA提取量为7. 53 士 2. 30 μ g/mL血液，平均OD值为1. 66 士 0. 13。2、琼脂糖凝胶电泳鉴定
将步骤一提取的15份DNA样本分别进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳。电泳结果表明，对比例的提取效果显著劣于实施例1的提取效果。部分样本的电泳图见图5。
权利要求
从血块中提取基因组DNA的方法，包括如下步骤(1)将血块在2-20牛顿压力下进行过滤，过滤孔径为40-130目，收集滤出液；(2)将滤出液与红细胞裂解液混匀后静置4-6分钟，然后9,000-13,000g离心0.5-1.5分钟，取沉淀；(3)将沉淀与细胞裂解液混匀后63-67℃水浴8-12分钟，然后9,000-13,000g离心0.5-1.5分钟，取上清；(4)将上清与异丙醇混匀后，用DNA结合柱进行纯化，得到基因组DNA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)为将血块在8-12牛顿压力 下进行第一次过滤，过滤孔径为40-60目，收集滤出液；然后将滤出液在8-12牛顿压力下进 行第二次过滤，过滤孔径为110-130目，收集滤出液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，第一次过滤的过滤孔径为 50目，第二次过滤的过滤孔径为120目。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，静置5分钟， 然后10，OOOg离心1分钟；所述步骤(3)中，65°C水浴10分钟，然后10，OOOg离心1分钟。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述步骤⑷为将步骤(3)得 到的上清与异丙醇混勻后转移到DNA结合柱，12，OOOg离心1分钟，弃流出液；然后在DNA 结合柱中加入75% (体积百分含量)乙醇水溶液，12，OOOg离心1分钟，弃流出液；然后在 DNA结合柱中加入75% (体积百分含量)乙醇水溶液，12000g离心1分钟，弃流出液；然后 将DNA结合柱12，OOOg离心2分钟，弃流出液；然后将DNA结合柱加入DNA溶解液，室温放置 2分钟；然后将DNA结合柱12，OOOg离心1分钟，收集流出液即为含有基因组DNA的溶液。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述血块、所述红细胞裂解 液、所述细胞裂解液、所述异丙醇的配比为2mL血块6mL红细胞裂解液ImL细胞裂解 液250 μ L异丙醇。
7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(2)和步骤(3)之 间还包括如下步骤将步骤(2)得到的沉淀与红细胞裂解液混勻后静置4-6分钟，然后 9，000-13, OOOg离心0. 5-1. 5分钟，取沉淀；所述步骤(2)和步骤(3)之间优选包括如下步 骤将步骤(2)得到的沉淀与红细胞裂解液混勻后静置5分钟，然后10，OOOg离心1分钟， 取沉淀，所述红细胞裂解液的加入量与步骤(2)中红细胞裂解液的加入量相同。
8.如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于所述红细胞裂解液由NH4C1、 KHC03、Na2EDTA 和水组成，pH 7. 4 ；NH4Cl 的浓度为 155mM，KHCO3 的浓度为 10mM，Na2EDTA 的浓 度为0. ImM ；所述细胞裂解液由扑士8-!1(1、恥(1、妝占01六、505、蛋白酶1(和水组成，？!1 8. 2 ； Tris-HCl的浓度为10mM，NaCl的浓度为400mM，Na2EDTA的浓度为2mM，SDS的浓度为(质量百分含量)，蛋白酶K的浓度为0. 5mg/mL ；所述DNA溶解液为pH7. 510mM的Tris-HCl 水溶液。
9.一种从血块中获得血液的方法，包括如下步骤将血块在8-12牛顿压力下进行第一 次过滤，过滤孔径为40-60目，收集滤出液；然后将滤出液在8-12牛顿压力下进行第二次过 滤，过滤孔径为110-130目，收集滤出液。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述第一次过滤的过滤孔径为50目，所述 第二次过滤的过滤孔径为120目。
全文摘要
本发明公开了一种从血块中快速提取基因组DNA的方法。本发明的方法包括如下步骤(1)将血块在2-20牛顿压力下进行过滤，过滤孔径为40-130目，收集滤出液；(2)将滤出液与红细胞裂解液混匀后静置4-6分钟，9,000-13,000g离心0.5-1.5分钟，取沉淀；(3)将沉淀与细胞裂解液混匀后63-67℃水浴8-12分钟，9,000-13,000g离心0.5-1.5分钟，取上清；(4)将上清与异丙醇混匀，用DNA结合柱进行纯化，得到基因组DNA。本发明的方法具有以下优点DNA提取量和纯度都显著提高；纯化步骤大大简化，节省大量时间；不使用任何有毒溶剂，保证工作人员的健康安全；使用廉价一次性物品，在降低成本的同时，避免潜在的交叉污染。本发明适于推广应用。
文档编号C12N5/07GK101886071SQ20101021071
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月18日 优先权日2010年6月18日
发明者张旭霞, 李传友, 李松, 车南颖 申请人:北京市结核病胸部肿瘤研究所