一种提取顽拗植物组织dna的新方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于DNA提取技术领域，设及一种提取顽樹植物组织DNA的新方法。
【背景技术】
[0002] DNA是基本遗传物质，是遗传信息的载体。一定数量及高质量的DNA样品是进行限 制性酶切、基因克隆、分子杂交、遗传多态性分析W及基因组学等分子生物学研究的基础。 因此，获取高质高量的DNA显得极为重要。由于不同植物甚至是同一种类植物组织材料的来 源、部位、形态等外在性质的不同W及化学成分、组织结构等内在特点的差异，其DNA提取难 易程度存在明显差异。从大多数的禾谷类及蔬菜类植物中提取DNA的难度就相对低于富含 多糖、多酪、单宁、色素等代谢物质的木本植物。分子生物学家称含有大量影响高质量分离 的初生次生物质的植物为顽樹植物，运类植物有梨、柿子、龙眼等。如何去除运些杂质是顽 樹植物获得高质量的DNA面临的主要问题。
[0003] 我国梨树栽培历史悠久，资源丰富，栽培面积和产量一直居世界首位，梨也是我国 发展最迅速的水果之一，在国内位居全国水果栽培总面积和总产量的第Ξ位。近些年，我国 科研工作者关于梨的分子生物学层面开展了众多研究，2012年5月，世界首个梨全基因组序 列图谱绘制也已经完成。梨作为多年生木本果树，其叶片、果皮等组织中富含多糖、酪类、单 宁和其他次生物质，运些次生物质与DNA共沉淀，形成粘稠的胶状物而难W溶解或产生褐 变;此外，梨果实水分含量大，尤其是成熟梨果肉组织DNA含量少。现有传统的CTAB法W及试 剂盒提取法对上述梨组织DNA的提取都存在不足之处:传统CTAB及其改良方法操作繁琐，且 获得的DNA纯度低，对上述梨组织DNA的提取量很有限，效率较低；试剂盒法仅适用于少量 DNA的提取。针对上述方法存在的不足，创新了一种提取梨组织DNA的新方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，在顽樹植物尤其是梨多种组织上进行 DNA的提取时，提供一种既保证较高的DNA纯度和浓度，又省时简便的DNA提取方法，W克服 上述【背景技术】中的缺点，提高DNA提取效率。
[000引本发明所解决的技术问题采用W下技术方案来实现：
[0006] -种提取顽樹植物组织DNA的方法，该方法所用抽提缓冲液是月桂酸钢抽提缓冲 液;所述的月桂酸钢抽提缓冲液，W500mL总量计，其配制方法是:称取月桂酸钢3~8g，氯化 钢2.5~3.5g，加入50mL浓度为0.5~2mol · L-ip册.0的Tris-HCl缓冲液、15~35mL浓度为 0.5mol · L-ip册.0的邸TA、400血d地2〇，调节抑至8.0，d地2〇定容至500血，灭菌后室溫保存。
[0007] 所述的月桂酸钢抽提缓冲液，W500mL总量计，其配制方法优选:称取月桂酸钢5g， 氯化钢2.925g，加入50mL浓度为Imol · L-ip册.0的Tris-Hcl、20mL浓度为0.5mol · L-ip册.0 的邸ΤΑ、400mLdd也0，调节pH至8.0，d地2〇定容至500mL，灭菌后室溫保存。
[0008] 所述的顽樹植物优选自梨、柿子、龙眼;进一步优选梨。
[0009 ]本发明所述的一方法，优选包含W下步骤：
[0010] (1)将梨组织样品置于经过液氮预冷的研鉢内，迅速研磨至粉状，研磨过程中防止 DNA被降解，期间应不断加入液氮。将研磨好的粉末移入抽提管中，加入月桂酸钢抽提缓冲 液，反复缓慢的摇匀；
[0011] (2)加入与步骤（1)月桂酸钢用量等体积的酪、氯仿和异戊醇混合液，再次反复缓 慢的摇匀后，4°C，12000rpm，离屯、15~20分钟，吸取上清液;所述的酪、氯仿和异戊醇混合液 中酪、氯仿和异戊醇体积比为20~30:20~28:1;
[0012] (3)加入步骤(2)中吸取的上清液总体积的0.7倍异丙醇，上下缓慢颠倒数次，静置 沉淀化W上，4°C，12000巧m，离屯、4~6分钟，倒去上清液；
[0013] (4)70%~75% (体积百分比）的乙醇洗涂步骤(3)所得沉淀，反复轻轻震荡洗涂，4 °C ,10000~1200化pm，离屯、5~10分钟，弃上清，重复此步骤两次；
[0014] (5)4°C ,10000~12000巧m，短暂离屯、20~30秒，吸干残留乙醇；
[0015] (6)置于37°C烘箱，使乙醇挥发干净；
[0016] (7)加入TE缓冲液，放置在恒溫箱溶解沉淀；
[0017] (8)待DNA完全溶解后，加入2~扣L的O.lmg ·血-iRNase，置于37°C烘箱30~60分钟 消化RNA。
[0018] 步骤(1)中梨组织与月桂酸钢提取缓冲液的用量关系进一步优选为：用2mLEP管提 取时，梨叶片、果皮组织可取0.1~0.2g，梨果肉组织因为水分多，取0.5~0.6g:月桂酸钢提 取缓冲液500~用50血抽提试管提取梨组织大片段DNA时，叶片、果皮组织可取2.5~ 5. Og，梨果肉组织可W取12.5~15. Og:月桂酸钢提取缓冲液12~18mL。
[0019] 步骤(3)中加入的异丙醇用量优选为步骤(2)吸取的上清液总体积的0.5~0.7倍， 静置时间为化W上;离屯、时的参数为:4°C，12000巧m，离屯、时间为4~6分钟。
[0020] 步骤（7)中lOOmL的TE缓冲液配制方法为：lmL的Imol · L-ipH = 8.0Tris-HCl缓冲 液、0.2mL的0.5mol · L-1抑= 8.0抓ΤΑ，加入约80mL dd出0均匀混合，用dd此明尋溶液定容到 lOOmL后，高溫高压灭菌后室溫保存;根据自己需要的DNA浓度选取TE缓冲液的用量，小片段 提取时加 50~2(K)yL，大片段提取时加 300~lOOOyL恒溫箱溫度为65°C。
[00引]步骤(8)中RNase的用量为0.1 mg · mL-i的RNase加入2~扣L烘箱溫度为37°C，时间 为30~60分钟。
[0022] 有益效果
[0023] (1)本发明中梨不同组织DNA提取方法中所用的提取缓冲液是月桂酸钢提取缓冲 液，月桂酸钢是一种阴离子表面活性剂，生物降解性很好，不仅有澄清去污作用，还可W促 进沉降。月桂酸钢可W很好地洗脱梨组织中存在的多糖、色素和多酪等次生物质，使沉降的 DNA纯度更高。
[0024] (2)采用本发明中的梨不同组织DNA提取的方法，样本量和试剂用量成倍性关系， 可W根据自己需要的DNA的用途与样品组织用量进行换算，灵活变通，所W在对大量梨组织 DNA的提取上也可W适用。
[0025] (3)本发明中月桂酸钢法提取步骤少，并且该方法不需要水浴，省时，操作简便，最 大程度地减小了提取过程中DNA的降解，DNA获得率高、较为完整，能够获得大量且纯度高的 DNA样品。
[0026] (4)本发明在梨果肉0.6g左右样品量中能提取到275.8雌/化的DNA浓度，在梨果皮 〇.15g左右样品量中能提取到194.4ng/化的DNA浓度，在梨叶片O.lOg左右样品量中能提取 到436.8叫/化的DNA浓度，并且OD260/280值都达到了 1.9W上（具体的数据见下表）。虽然用 CTAB法提取0. lOg梨叶片得到平均735. lng/化的DNA浓度，但是CTAB法提取的基因组DNA条 带拖尾弥散，杂质多，