一种从植物叶片快速提取dna的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及本发明属于农业生物技术与分子生物学领域，涉及一种利用叶片组织快速提取甜菜总DNA的方法。
【背景技术】
[0002]甜菜栽培种包括叶用甜糖、饲料甜菜、食用甜菜以及糖用甜菜，在农业生产上具有广泛应用。
[0003]糖甜菜是重要的糖料作物之一，叶用甜菜及食用甜菜具有极高的食用及医用价值，饲料甜菜是优良的动物饲料之一。生物工程及生物技术手段应用于甜菜种质资源的分子遗传育种及品种改良离不开甜菜DNA的提取。
[0004]目前包括甜菜属在内的植物DNA提取常用的方法源于经典的SDS法，CTAB法，磁珠法等方法经过改良或修饰，但这些方法存在步骤多，样品前期处理复杂，操作时间长；化学试剂多，离不开苯酚、饱和酚、巯基乙醇、异硫氰酸胍等对人体有害的有毒试剂，有些方法还要附加蛋白酶K、RNA酶、DTT等价格昂贵的试剂，而且所需组织材料量多；使用商品化试剂盒提取植物DNA虽然步骤明显简化也没有本发明方法简单，购买试剂盒不仅成本高，而且其含有的强变性剂成分对皮肤有伤害作用。
[0005]本发明只使用提取液、分离液、沉淀液3种溶剂，3次离心，从叶片中快速获得甜菜总DNA。高温水浴及2次分离液分离过程，高速离心，有效的去除了蛋白及多糖等杂质，_20°C预冷沉淀液加速DNA沉淀效果。本方法样品前期处理简单，只需少量叶片(5mg-50mg)直接在离心管中研磨即可，使用有毒化学试剂成分少，避免了试验操作过程中巯基乙醇、酚等化学试剂对人体危害及环境污染；获得的甜菜DNA纯度好，琼脂糖电泳带型清晰，荧光分光光度计检测0D260/0D280为1.75-1.82之间，0D260/0D230为2.05-2.16之间，可直接进行PCR扩增试验应用于分子标记、指纹图谱等分子生物学试验，为农业生物技术分子育种及分子生物学领的研宄提供了前期DNA核酸基础材料。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是为了解决现有植物DNA提取方法存在样品处理复杂、步骤多、时间长、对环境及人体有毒化学试剂成分多、试剂价格高等问题，而提供了利用少量叶片组织快速提取甜菜总DNA的方法。
[0007]本发明的一种从植物叶片快速提取DNA的方法，它是按照以下步骤进行的:
[0008]一、取植物叶片置于离心管内，直接在离心管内研磨叶片；
[0009]二、向步骤一中研磨完叶片后的离心管中加入5?8倍叶片体积的提取缓冲液，得叶片组织混合液；在水浴温度为55°C?65°C的条件下处理15?30min，然后加入与叶片混合液等体积的分离液，进行高速离心，取上清液加入等体积的分离液，再进行高速离心；取上清液加入2/3体积的沉淀液，直接进行低速离心，去上清收集沉淀；
[0010]三、将步骤二收集的沉淀加入灭菌水或TE缓冲液保存于-20°C中，即完成所述的从甜菜叶片快速提取DNA;
[0011]其中，提取缓冲液配方为:浓度为lOOmmol/L的Tris *C1溶液，浓度为20mmol/L的Na2EDTA.2H20溶液，浓度为1.6mol/L的NaCl溶液，质量百分含量为2.0 %的CTAB溶液；
[0012]分离液为氯仿\异戊醇按体积比为25:1的比例混合后的混合液；
[0013]DNA沉淀液为在_20°C预冷不小于20min的异丙醇溶液。
[0014]本发明包含以下有益效果:
[0015]本发明的方法快速省时，只需30分钟，试验所需器材、药品少，成本低，易于操作，实验效果良好。获得DNA包括核基因组DNA、线粒体DNA以及叶绿体DNA、可直接用于PCR扩增细胞核或细胞质中基因片段，也可应用于分子标记、指纹图谱等分子生物学试验，为农业生物技术中分子育种及分子生物学领域后续目的基因的克隆、转化研宄的进行提供了 DNA核酸基础材料。
[0016]本发明只需要取少量(5mg?50mg)叶片即可完成DNA提取，本发明将取到的叶片放入1.2ml EfTendorf离心管内研磨后，即可进行后续操作，不需要再更换离心管，减少了研钵、试管等耗材用量及一些不必要地污染，样品处理简单、快速、成本低，适合大批量样品DNA的快速提取试验。另外，本发明在采用液氮研磨叶片时，是将装有叶片的盖盖离心管从装有液氮的容器中取出后迅速进行研磨，而不是将液氮倒入离心管或研钵内直接接触叶片样品，防止了液氮中杂质污染叶片组织，同时避免了液氮接触样品瞬间挥发对操作者皮肤的伤害；本发明采用14000r/min?16000r/min的转速离心5分钟进行DNA分离，即可，而并非采用常规的低速离心，致使分离效果差，残留少量蛋白质；本发明采用-20°C冰箱中充分冷冻的沉淀液直接沉淀DNA，不需要沉淀时间，直接进行下一步操作，节省时间且效果好。
[0017]此外，本发明分离液只有氯仿\异戊醇，并不含有酚，提取液中不含有巯基乙醇，因此，不存在强毒性地物质，对人体造成伤害并污染环境，从而也省去了后续的一些去除这些化学物质的操作步骤。
【附图说明】
[0018]图1为提取的甜菜DNA琼脂糖电泳结果图；其中，M:DL2000 Marker ;泳道I?3分别为三种不同的栽培甜菜。
【具体实施方式】
[0019]【具体实施方式】一:本实施方式的一种从植物叶片快速提取DNA的方法，它是按照以下步骤进行的:
[0020]一、取植物叶片置于离心管内，直接在离心管内研磨叶片；
[0021]二、向步骤一中研磨完叶片后的离心管中加入5?8倍叶片体积的提取缓冲液，得叶片组织混合液；在水浴温度为55°C?65°C的条件下处理15?30min，然后加入与叶片混合液等体积的分离液，进行高速离心，取上清液加入等体积的分离液，再进行高速离心；取上清液加入2/3体积的沉淀液，直接进行低速离心，去上清收集沉淀；
[0022]三、将步骤二收集的沉淀加入灭菌水或TE缓冲液保存于_20°C中，即完成所述的从甜菜叶片快速提取DNA;
[0023]其中，提取缓冲液配方为:浓度为lOOmmol/L的Tris *C1溶液，浓度为20mmol/L的Na2EDTA.2H20溶液，浓度为1.6mol/L的NaCl溶液，质量百分含量为2.0 %的CTAB溶液；
[0024]分离液为氯仿\异戊醇按体积比为25:1的比例混合后的混合液；
[0025]DNA沉淀液为在-20°C预冷不小于20min的异丙醇溶液。
[0026]本实施方式所述的DNA包括细胞核内基因组DNA以及细胞质中DNA ;例如线粒体DNA,叶绿体DNA。
[0027]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤一中所述的植物叶片来源于生长期及器官部位的叶片组织。其它与【具体实施方式】一相同。
[0028]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:所述的生长期及器官部位的叶片组织为营养生长阶段时期的叶片、生殖生长阶段抽薹花枝上叶片或块状根顶部叶片。其它与【具体实施方式】一相同。
[0029]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:所述的叶片组织为子叶的叶片、真叶的叶片、新叶的叶片、老叶的叶片、干叶的叶片或冻叶的叶片。其它与【具体实施方式】一相同。
[0030]本实施方式中所述的新叶指各生长时期的新鲜嫩叶片，老叶指营养生长后期外部萎蔫叶片及采摘后室温储藏的萎蔫叶片。
[0031]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:所述的植物叶片为甜菜叶片。其它与【具体实施方式】一相同。
[0032]本实施方式所述的甜菜为甜菜(Beta)属内的所有种和亚种，以及所有种类的栽培甜菜和野生甜菜；其中，栽培甜菜分为4组:叶用甜菜(Ieafbeet)，饲料甜菜(fodderbeet)，食用甜菜(garden beet)以及糖用甜菜(sugar beet)。
[0033]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤二中在水浴温度为58°C?65°C的条件下处理15min。其它与【具体实施方式】一相同。
[0034]【具体实施方式】七:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤二中在水浴温度为60°C的条件下处理15min。其它与【具体实施方式】一相同。
[0035]【具体实施方式】八:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤二中加分离液离心的条件为在转速为14000r/min?16000r/min的条件下离心5?10分钟。其它与【具体实施方式】一相同。
[0036]【具体实施方式】九:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:Tris ?Cl溶液的pH =8.0o其它与【具体实施方式】一相同。
[0037]【具体实施方式】十:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:Na2EDTA.2H20溶液的PH = 8.0ο其它与【具体实施方式】一相同。
[0038]【具体实施方式】^^一:本实施方式与【具体实施方式】一