一种干燥植物组织的dna提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种针对干燥植物组织的DNA提取方 法。
【背景技术】
[0002] 在二代和三代测序技术中，获得纯度好、完整性高的基因组DNA是文库构建顺利 完成并获得真实、完整的基因组信息的前提和关键。植物组织的特点是含有多种复杂的次 生代谢物，特别是多糖多酚类化合物，不仅难去除，还会介导基因组DNA的降解，并对后续 酶反应有一定的抑制作用；此外，对于野外采集只能采取干燥保存的植物组织，不仅次生 代谢物含量明显偏高，基因组DNA降解的风险也会加大。目前常用的植物组织DNA提取方 法，如常规CTAB (Hexadecyltrimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵）法、 SDS(Sodium dodecyl sulfate，十二烷基磺酸钠）法、试剂盒（过柱法和磁珠法），既不能保 证梨、猕猴桃等多糖或其它杂质含量高的基因组DNA的纯度，也不能克服干燥保存植物组 织提取DNA的降解问题，这些方法提取的基因组DNA在二代和三代测序技术中会造成文库 构建失败或信息分析异常。
【发明内容】
[0003] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种针对干燥植物组织的 DNA提取方法。
[0004] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：、
[0005] -种干燥植物组织的DNA提取方法，所述方法利用改良CTAB裂解液进行干燥植物 组织的细胞裂解；所述改良CTAB裂解液的组分为：2% CTAB，2 % PVP40, IOOmM Tris-HCl， 25mM EDTA，2M NaCl，350mM 山梨醇，IOOmM Na2S03,2% β-巯基乙醇。
[0006] 进一步地，所述方法包括以下步骤：
[0007] (一）将样品在预冷的研钵中充分研磨成粉末状；
[0008] (二）将样品粉末加入预热的改良CTAB裂解液中混勾，使样品悬浮，温浴30~ 60min ;取出冷却至室温，离心取上清；
[0009] (三）经氯仿-异戊醇抽提离心取上清；
[0010] (四）加入乙酸钠和异丙醇进行DNA沉淀；
[0011] (五）经乙醇清洗后离心得到DNA沉淀，干燥后加入含Rnase A的超纯水溶解DNA 沉淀，消化RNA。
[0012] 其中，所述步骤（二）将样品粉末加入65°C预热的改良CTAB裂解液中混匀，使样 品悬浮，65°C温浴30~60min ;取出冷却至室温，离心取上清。
[0013] 其中，所述步骤（二）在温浴期间摇匀2~3次，保证细胞充分裂解。
[0014] 其中，所述步骤（三）中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
[0015] 其中，所述步骤（四）加入相对于上清液1/10体积的3M乙酸钠和相对于上清液 2/3体积预冷的异丙醇进行DNA沉淀。
[0016] 更进一步地，所述方法包括以下步骤：
[0017] 1)将样品移至预冷的研钵中，用预冷的研杵将组织充分研磨成粉末状；然后用液 氮预冷的小勺将样品粉末转移至无菌离心管中；
[0018] 2)立即加入65°C预热的改良CTAB裂解液，剧烈震动混匀，使样品完全悬浮，65°C 温浴30~60min ;取出后，冷却至室温，离心取上清液至新无菌离心管中；
[0019] 3)加入氯仿-异戊醇，缓慢上下颠倒多次，室温离心；
[0020] 4)吸取上清液至新无菌离心管，加入等体积氯仿：异戊醇，上下颠倒多次，室温离 心；
[0021] 5)吸取上清液至新无菌离心管中，加入乙酸钠和异丙醇，充分混匀，-20°C放置 lh，室温离心，弃上清，瞬时离心，弃上清；
[0022] 6)加入70%乙醇清洗沉淀两次，离心弃上清；瞬时离心，吸弃残留液体，干燥至 DNA沉淀呈半透明状；
[0023] 7)根据DNA沉淀量加入含20 μ g/L Rnase A的超纯水溶解DNA沉淀，消化RNA。
[0024] 作为优选，所述方法包括以下步骤：
[0025] 1)将100mg-200mg植物组织材料移至预冷的研钵中，用预冷的研杵将组织充分研 磨成粉末状；然后用液氮预冷的小勺将样品粉末转移至2. OmL无菌离心管中；
[0026] 2)立即加入ImL 65°C预热的改良CTAB裂解液，剧烈震动混匀，使样品完全悬浮， 65°C温浴30min至60min，温浴期间摇匀2~3次，保证细胞充分裂解；取出后，冷却至室温， 8000rpm室温离心5min，取800 μ L上清液至新的2. OmL无菌离心管中；
[0027] 3)加入800 μ L氯仿-异戊醇，缓慢上下颠倒100次，12000rpm室温离心20min ;
[0028] 4)吸取600 μ L上清液至新的2. OmL无菌离心管，加入等体积氯仿：异戊醇，上下 颠倒100次，12000rpm室温离心20min ;
[0029] 5)吸取400 μ L上清液至新的I. 5mL无菌离心管中，加入相对于上清液1/10体积 的3M乙酸钠和相对于上清液2/3体积预冷的异丙醇，充分混匀，-20°C放置lh，12000rpm室 温离心10min，弃上清，瞬时离心，弃上清；
[0030] 6)加入ImL 70%乙醇清洗沉淀两次，7500rpm离心5min，弃上清；瞬时离心，吸弃 残留液体，37°C或室温干燥5min，至DNA沉淀呈半透明状；
[0031 ] 7)根据DNA沉淀量加入适量含20 μ g/L Rnase A的超纯水溶解DNA沉淀，37 °C消 化 30min。
[0032] 本发明还提供了一种用于干燥植物组织DNA提取的改良CTAB裂解液，改良CTAB 裂解液的组分为：2% CTAB，2% PVP40, IOOmM Tris-HCl (ρΗ8· 0)，25mM EDTA，2M NaCl，350mM 山梨醇，IOOmM Na2SO3, 2% β-巯基乙醇。
[0033] 本发明的有益效果在于：
[0034] 本发明在改良CTAB裂解液中增加了 PVP和亚硫酸钠，有效的抑制了酚醌类次生代 谢物氧化造成的所提基因组DNA纯度低，并提尚了 DNA的完整性。
【附图说明】
[0035] 图1为本发明实施例2所提基因组DNA进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测的结果。
[0036] 图2为本发明对比例1所提基因组DNA进行I. 0%琼脂糖凝胶电泳检测的结果。
【具体实施方式】
[0037] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0038] 实施例1改良CTAB裂解液
[0039] 在常规CTAB裂解液配方的基础上添加了 PVP40、山梨醇和亚硫酸钠，得到了改良 CTAB裂解液。
[0040] 所述改良CTAB裂解液的组分为：
[0041] 2% CTAB，2% PVP40, IOOmM Tris-HCl，25mM EDTA，2M NaCl，350mM 山梨醇，IOOmM Na2SO3, 2% β-巯基乙醇。
[0042] 实施例2海带干燥叶片基因组DNA提取
[0043] 1.将100mg-200mg植物组织材料移至预冷的研钵中，用预冷的研杵将组织充分研 磨成粉末状；而后用液氮预冷的小勺将样品粉末转移至2. OmL无菌离心管中。<