一种用于次生代谢物含量高的植物组织的dna提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种用于次生代谢物含量高的植物组 织的DNA提取方法。
【背景技术】
[0002] 在二代和三代测序技术中，获得纯度好、完整性高的基因组DNA是文库构建顺利 完成并获得真实、完整的基因组信息的前提和关键。植物组织的特点是含有多种复杂的次 生代谢物，特别是多糖多酚类化合物，不仅难去除，还会介导基因组DNA的降解，并对后续 酶反应有一定的抑制作用，次生代谢物含量偏高，基因组DNA降解的风险也会加大。目前常 用的植物组织DNA提取方法，如常规CTAB (Hexadecyltrimethyl ammonium bromide，十六烧 基三甲基溴化铵）法、SDS (Sodium dodecyl sulfate，十二烷基磺酸钠）法、试剂盒（过柱 法和磁珠法），不能保证猕猴桃、侧柏等多糖或其它杂质含量高的基因组DNA的纯度，这些 方法提取的基因组DNA在二代和三代测序技术中会造成文库构建失败或信息分析异常。
【发明内容】
[0003] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于次生代谢物含量 高的植物组织的DNA提取方法。
[0004] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0005] -种用于次生代谢物含量高的植物组织的DNA提取方法，所述方法在进行细 胞裂解前，利用干扰物清除液对植物组织进行处理；所述干扰物清除液的组分为：l〇〇mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM EDTA，5%甘油，10%PEG8000，1% β-巯基乙醇。
[0006] 进一步地，所述方法包括以下步骤：
[0007] (一）将样品在预冷的研钵中充分研磨成粉末状；
[0008] (二）加入干扰物清除液清洗，振荡离心弃上清液；
[0009] (三）加入预热的CTAB裂解液中混勾，使样品悬浮，温浴30~60min ;取出冷却至 室温，离心取上清；
[0010](四）经氯仿-异戊醇抽提离心取上清；
[0011] (五）加入无水乙醇进行DNA沉淀；
[0012] (六）经乙醇清洗后离心得到DNA沉淀，干燥后加入含Rnase A的超纯水溶解DNA 沉淀，消化RNA。
[0013] 其中，所述步骤（三）加入65 °C预热的CTAB裂解液中混勾，使样品悬浮，65 °C温浴 30~60min ;取出冷却至室温，离心取上清。
[0014] 其中，所述步骤（二）加入干扰物清除液，振荡离心弃上清液，重复清洗至上清液 不粘桐。
[0015] 其中，所述步骤（四）中氯仿与异戊醇的体积比为24:1。
[0016] 其中，所述步骤（五）加入相对于上清液0· 35倍体积的无水乙醇进行DNA沉淀。
[0017] 更进一步地，所述方法包括以下步骤：
[0018] 1)将组织样品移至预冷的研钵中，用预冷的研杵将组织充分研磨成粉末状；然后 用液氮预冷的小勺将样品粉末转移至无菌离心管中；
[0019] 2)立即加入干扰物清除液，振荡离心弃上清液，重复清洗至上清液基本不粘稠；
[0020] 3)加入65°C预热的CTAB裂解液，剧烈震动混勾，使样品完全悬浮，65°C温浴30min 至60min ;取出后，冷却至室温，室温离心取上清液至新无菌离心管中；
[0021] 4)加入氯仿-异戊醇，缓慢上下颠倒多次，室温离心；
[0022] 5)吸取上清液至新无菌离心管，加入等体积氯仿-异戊醇，上下颠倒多次，室温离 心；
[0023] 6)吸取上清液至新无菌离心管中，加入无水乙醇，迅速混匀，4°C放置过夜，室温离 心，弃上清，瞬时离心，弃上清；
[0024] 7)加入70%乙醇清洗沉淀两次，离心弃上清；瞬时离心，吸弃残留液体，干燥至 DNA沉淀呈半透明状；
[0025] 8)根据DNA沉淀量加入含20 μ g/L Rnase A的超纯水溶解DNA沉淀，消化RNA。
[0026] 作为优选，所述方法包括以下步骤：
[0027] 1)将IOOmg植物组织材料移至预冷的研钵中，用预冷的研杵将组织充分研磨成粉 末状；而后用液氮预冷的小勺将样品粉末转移至2. OmL无菌离心管中；
[0028] 2)立即加入ImL干扰物清除液，振荡lmin，12000g离心10min，弃上清液，重复清 洗至上清液基本不粘稠；
[0029] 3)加入ImL 65°C预热的CTAB裂解液，剧烈震动混匀，使样品完全悬浮，65°C温 浴30min至60min ;取出后，冷却至室温，8000rpm室温离心5min，取800 μ L上清液至新的 2. OmL无菌离心管中；
[0030] 4)加入800 μ L氯仿-异戊醇，缓慢上下颠倒100次，上下为1次，12000rpm室温 离心20min ;
[0031] 5)吸取600 μ L上清液至新的2. OmL无菌离心管，加入等体积氯仿-异戊醇，上下 颠倒100次，12000rpm室温离心20min ;
[0032] 6)吸取400 μ L上清液至新的I. 5mL无菌离心管中，加入0. 35倍体积无水乙醇，迅 速混勾，4°C放置过夜，12000rpm室温离心10min，弃上清，瞬时离心，弃上清；
[0033] 7) ImL 70%乙醇清洗沉淀两次，7500rpm离心5min，弃上清；瞬时离心，吸弃残留 液体，37°C或室温干燥5min，至DNA沉淀呈半透明状；
[0034] 8)根据DNA沉淀量加入适量含20 μ g/L Rnase A的超纯水溶解DNA沉淀，37 °C消 化 30min。
[0035] 本发明还提供了一种用于次生代谢物含量高的植物组织DNA提取的干扰物清 除液，所述干扰物清除液的组分为=IOOmM Tris-HCl (pH8.0)，5mM EDTA，5 %甘油，10 % PEG8000，1% β-巯基乙醇。
[0036] 本发明的有益效果在于：
[0037] 本发明利用干扰物清除液对粉碎的植物组织进行漂洗，并结合0. 35倍体积无水 乙醇4°C过夜沉淀DNA，有效除去因化学性质和DNA相似而难以去除的多糖类杂质，大幅提 高了所提基因组DNA的纯度。
【附图说明】
[0038] 图1为本发明实施例2所提基因组DNA进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测的结果。
[0039] 图2为本发明实施例3所提基因组DNA进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测的结果。
[0040] 图3为本发明对比例1所提基因组DNA进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测的结果。
[0041] 图4为本发明对比例2所提基因组DNA进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测的结果。
【具体实施方式】
[0042] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0043] 实施例1用于次生代谢物含量高的植物组织DNA提取的干扰物清除液
[0045] 实施例2侧柏叶基因组DNA提取（含有挥发油、鞣质、树脂等复杂次生代谢物）
[0046] 1.将IOOmg植物组织材料移至预冷的研钵中，用预冷的研杵将组织充分研磨成粉 末状；而后用液氮预冷的小勺将样品粉末转移至2. OmL无菌离心管中；
[0047] 2.立即加入ImL干扰物清除液，振荡lmin，12000g离心10min，弃上清液，重复清 洗至上清液基本不粘稠；
[0048] 3.加入ImL 65°C预热的CTAB裂解液，剧烈震动混匀，使样品完全悬浮，65°C温浴 30min至60min (温浴期间摇匀2~3次，保证细胞充分裂解）；取出后，冷却至室温，8000rpm 室温离心5min，取800 μ L上清液至新的2. OmL无菌离心管中；
[0049] 4.加入800 yL氯仿-异戊醇（24:1)，缓慢上下颠倒100次（上下为1次）， 12000rpm 室温离心 20min ;
[0050] 5.吸取600