μ L上清液至新的2. OmL无菌离心管，加入等体积氯仿-异戊醇 (24:1)，上下颠倒100次，12000rpm室温离心20min ;
[0051] 6.吸取400 μ L上清液至新的I. 5mL无菌离心管中，加入0. 35倍体积无水乙醇，迅 速混勾，4°C放置过夜，12000rpm室温离心10min，弃上清，瞬时离心，弃上清；
[0052] 7. ImL 70%乙醇清洗沉淀两次，7500rpm离心5min，弃上清；瞬时离心，吸弃残留 液体，37°C干燥5min (或室温干燥），至DNA沉淀呈半透明状；
[0053] 8.根据DNA沉淀量加入适量含20 μ g/L RNase A的超纯水溶解DNA沉淀，37 °C消 化 30min。
[0054] 9. Nanodrop 2000 (Thermo)检测浓度，并取500ng进行琼脂糖凝胶电泳。NaNodrop 2000检测结果见表1，琼脂糖凝胶电泳见图1。
[0055] 表1检测结果
[0058] 实施例3猕猴桃叶片基因组DNA提取（多糖含量高样品）
[0059] 提取步骤与实施例2相同，NaNodrop 2000检测结果见表2,琼脂糖凝胶电泳见图 2〇
[0060] 表2检测结果
[0062] 对比例1
[0063] 本对比例与实施例2的区别在于：未经干扰物清除液处理进行DNA提取，用1/10 体积3M乙酸钠和2/3体积异丙醇进行沉淀。
[0064] NaNodrop 2000检测结果见表3,琼脂糖凝胶电泳见图3。
[0065] 表3检测结果
[0067] 从电泳图可以看出，实施例2用干扰物清除液清洗结合0. 35倍无水乙醇4°C沉淀 的方法所提取的基因组DNA条带整齐，而本对比例中相同样品由于杂质的干扰基因组DNA 在琼脂糖凝胶电泳时不能正常迀移，从而出现条带变形拖溢现象。可见，本发明提供的方法 对于杂质的去除效果非常有效。
[0068] 对比例2
[0069] 本对比例与实施例3的区别在于：利用干扰物清除液清洗三次，但用1/5体积乙酸 铵、等体积异丙醇进行沉淀。
[0070] NaNodrop 2000检测结果见表4,琼脂糖凝胶电泳见图4。
[0071] 表4检测结果
[0073] 从电泳图可以看出，实施例3用干扰物清除液清洗结合0. 35倍无水乙醇4°C沉淀 的方法所提取的基因组DNA条带整齐，而本对比例中相同样品由于多糖类杂质去除效果不 佳，导致所提DNA溶液呈现出明显粘稠状态，同时琼脂糖凝胶电泳迀移异常。可见，本发明 利用干扰物清除液结合〇. 35倍无水乙醇4°C沉淀的方法对于多糖类杂质的去除效果非常 明显。
[0074] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种用于次生代谢物含量高的植物组织的DNA提取方法，其特征在于，所述方法在 进行细胞裂解前，利用干扰物清除液对植物组织进行处理；所述干扰物清除液的组分为： IOOmM Tris-HCl(pH8.0)，5mM EDTA，5%甘油，10%PEG8000，1% (6-巯基乙醇。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (一） 将样品在预冷的研钵中充分研磨成粉末状； (二） 加入干扰物清除液清洗，振荡离心弃上清液； (三） 加入预热的CTAB裂解液中混匀，使样品悬浮，温浴30~60min ;取出冷却至室 温，离心取上清； (四） 经氯仿-异戊醇抽提离心取上清； (五） 加入无水乙醇进行DNA沉淀； (六） 经乙醇清洗后离心得到DNA沉淀，干燥后加入含Rnase A的超纯水溶解DNA沉 淀，消化RNA。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（三）加入65°C预热的CTAB裂 解液中混匀，使样品悬浮，65°C温浴30~60min ;取出冷却至室温，离心取上清。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（二）加入干扰物清除液，振荡 离心弃上清液，重复清洗至上清液不粘稠。5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（四）中氯仿与异戊醇的体积比 为 24:1。6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（五）加入相对于上清液0. 35 倍体积的无水乙醇进行DNA沉淀。7. 根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 1) 将组织样品移至预冷的研钵中，用预冷的研杵将组织充分研磨成粉末状；然后用液 氮预冷的小勺将样品粉末转移至无菌离心管中； 2) 立即加入干扰物清除液，振荡离心弃上清液，重复清洗至上清液基本不粘稠； 3) 加入65°C预热的CTAB裂解液，剧烈震动混勾，使样品完全悬浮，65°C温浴30min至 60min ;取出后，冷却至室温，室温离心取上清液至新无菌离心管中； 4) 加入氯仿-异戊醇，缓慢上下颠倒多次，室温离心； 5) 吸取上清液至新无菌离心管，加入等体积氯仿-异戊醇，上下颠倒多次，室温离心； 6) 吸取上清液至新无菌离心管中，加入无水乙醇，迅速混匀，4°C放置过夜，室温离心， 弃上清，瞬时离心，弃上清； 7) 加入70 %乙醇清洗沉淀两次，离心弃上清；瞬时离心，吸弃残留液体，干燥至DNA沉 淀呈半透明状； 8) 根据DNA沉淀量加入含20 y g/L Rnase A的超纯水溶解DNA沉淀，消化RNA。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 1) 将IOOmg植物组织材料移至预冷的研钵中，用预冷的研杵将组织充分研磨成粉末 状；而后用液氮预冷的小勺将样品粉末转移至2. OmL无菌离心管中； 2) 立即加入ImL干扰物清除液，振荡lmin，12000g离心10min，弃上清液，重复清洗至 上清液基本不粘桐； 3) 加入ImL 65°C预热的CTAB裂解液，剧烈震动混匀，使样品完全悬浮，65°C温浴30min 至60min ;取出后，冷却至室温，8000rpm室温离心5min，取800 Ii L上清液至新的2. OmL无 菌离心管中； 4)加入800 y L氯仿-异戊醇，缓慢上下颠倒100次，上下为1次，12000rpm室温离心 20min ； 5) 吸取600 y L上清液至新的2. OmL无菌离心管，加入等体积氯仿-异戊醇，上下颠倒 100 次，12000rpm 室温离心 20min ; 6) 吸取400 y L上清液至新的I. 5mL无菌离心管中，加入0. 35倍体积无水乙醇，迅速混 勾，4°C放置过夜，12000rpm室温离心10min，弃上清，瞬时离心，弃上清； 7. ImL 70%乙醇清洗沉淀两次，7500rpm离心5min，弃上清；瞬时离心，吸弃残留液体， 37°C或室温干燥5min，至DNA沉淀呈半透明状； 8) 根据DNA沉淀量加入适量含20 y g/L Rnase A的超纯水溶解DNA沉淀，37°C消化 30min〇9. 一种用于次生代谢物含量高的植物组织DNA提取的干扰物清除液，其特征在于，所 述干扰物清除液的组分为=IOOmM Tris-HCl，5mM EDTA，5%甘油，10% PEG8000,1 % P -巯 基乙醇。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，具体提供了一种用于次生代谢物含量高的植物组织的DNA提取方法，所述方法在进行细胞裂解前，利用干扰物清除液对植物组织进行处理，并用0.35倍无水乙醇对抽提上清液进行4℃沉淀；所述干扰物清除液的组分为：100mM？Tris-HCl(pH8.0)，5mM？EDTA，5％甘油，10％PEG8000，1％β-巯基乙醇。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105018463
【申请号】CN201510303273
【发明人】郑洪坤, 刘慧 , 张蕾
【申请人】北京百迈客生物科技有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年6月5日