一种提取dna的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测领域，具体涉及提取超微量和/或被污染和/或高度降解的DNA的方法。
【背景技术】
[0002]高通量测序(又称新一代测序、二代测序，Next-generat1n sequencing)可以一次性测定大量核酸序列，被广泛用于基因组、转录组研宄，并在医学、法医等领域也获得诸多应用。高通量测序的基本原理是将待测DNA随机打断成小片段，经末端修复、连接接头序列并进行PCR (称为“建库”过程)，然后使用Illumina，1n Torrent等测序仪进行测序(M.L.Metzker, Sequencing technologies—the next generat1n, Nature reviews.Genetics 11, 31 - 46 (2010)) o但全面测定基因组信息需要较多的DNA量作为起始来进行建库，通常不少于100ng。当DNA的量低于这一量时，建库效率急剧降低，以致无法进行测序。为了解决超微量样品的测序问题，人们研宄了所谓的“单细胞测序”(single-cellsequencing)技术，即采用几百、几十个甚至单个细胞内提取出的DNA作为起始DNA来进行测序。目前所有的单细胞测序技术都基于全基因组扩增方案，使用模板依赖性的DNA聚合酶(多用Phi29DNA聚合酶)对单个基因组DNA分子进行扩增，从而使DNA量满足测序建库的起始量要求。目前主要应用的实施方案分为多重置换扩增(MDA)、单引物等温扩增(SPIA)、MALBAC 三大类(Dean, F.B.等人，“Comprehensive human genome amplificat1n usingmultiple displacement amplificat1n,，，Proc Natl Acad Sci USA, 99:5261-6，2002 ;Kurn N 等人，Novel isothermal, linear nucleic acid amplificat1n systems forhighly multiplexed applicat1ns, Clin Chem, 51(10):1973-81, 2005 ；Zong, C 等人，αGenome-wide detect1n of single-nucleotide and copy-number variat1ns of asingle human cell, ” Science, 338:1622-6，2012)。考虑到一个人细胞基因组 DNA 大约为3.5pg，MDA和MALBAC都已实现对单细胞基因组DNA扩增，而SPIA需要的最低起始量为Ing (约300个人细胞)。
[0003]但这些单细胞测序技术都有着共同的局限性，主要体现在两点:(I)要求较长的DNA连续片段；(2)对污染DNA极端敏感。而这两点往往在实际应用中难以保证。实际医学应用中从冰冻切片、石蜡包埋切片中提取的DNA往往已被打断，法医应用中从高度腐烂尸体中提取的DNA也早已降解成小片段(根据保存条件的不同，可降解成20?500bp小片段)，因而难以使用全基因组扩增方案。同时，提取出的DNA样本中往往混有数量可观的微生物DNA的污染，在操作时也极易被环境中的微生物所污染，若使用全基因组扩增方案，优先扩增的将是污染的微生物DNA，致使最后测序结果中绝大部分序列都是污染的微生物DNA0
[0004]此外，超微量建库方法还常常遇到的挑战是DNA的提取。在传统的DNA提取方案中(包括基于酚-氯仿体系的提取方案和基于硅吸附的提取方案)，均使用乙醇或其类似物对DNA进行洗涤和沉淀，而DNA微溶于乙醇及其类似物。当DNA量极微的时候，DNA可能全部溶于乙醇而损失。若加入糖原等物质帮助沉淀，糖原会一同沉淀下来，可能干扰一些后续反应；若加入carrier DNA (如在人的微量DNA样品中加入大量细菌、酵母等DNA)帮助沉淀，会人为引入污染，虽然对普通单基因PCR实验没有影响，但会严重影响高通量测序的结果，致使最后测序结果中绝大部分序列都是carrier DNA。
[0005]综上所述，本领域中存在对于能够有效提取极微量DNA、高度降解的DNA和/或被污染的DNA的方法的需要。
【发明内容】
[0006]鉴于上述问题，提出了本发明，以便提供一种提取DNA的方法，以克服上述问题或者至少部分地解决上述问题。
[0007]在第一方面，本发明提供一种DNA提取方法，所述方法包括在有待提取DNA的生物样品中加入环状DNA。
[0008]在第二方面，本发明提供一种DNA文库构建方法，所述方法包括采用第一方面所述的方法进行DNA提取。
[0009]本发明的DNA文库构建方法可以包括:
[0010](I)在所述生物样品中加入环状DNA ；
[0011 ] (2)提取所述生物样品中的DNA ；
[0012](3)将所提取的DNA与接头序列连接，之后进行PCR扩增；和
[0013](4)通过凝胶电泳分离扩增后的DNA片段，完成文库构建。
[0014]本发明的DNA文库构建方法还可以包括:
[0015]步骤⑵和步骤(3)之间进行步骤(2’ ):对所述DNA进行末端修复。
[0016]在本发明的DNA提取方法或DNA文库构建方法中，所述生物样品可以为其中DNA高度降解和/或被污染的样品和/或微量样品。
[0017]在本发明的DNA提取方法或DNA文库构建方法中，所述生物样品可以包含已降解至30-40bp的DNA片段。
[0018]在本发明的DNA提取方法或DNA文库构建方法中，其中所述环状DNA的长度可以大于所述生物样品中最长DNA片段的长度至少500bp-20kb和/或所述环状DNA的长度可以小于所述生物样品中最短DNA片段的长度至少500bp-1000bp。。
[0019]在本发明的DNA提取方法或DNA文库构建方法中，所述环状DNA可以为细菌质粒DNA，优选地可以为高纯度的细菌质粒DNA。
[0020]在本发明的DNA提取方法或DNA文库构建方法中，所述细菌环状质粒DNA可以通过柱式质粒提取试剂盒提取。
[0021]在本发明的DNA提取方法或DNA文库构建方法中，所述生物样品可以为动物生物样品、微生物生物样品或植物生物样品。
[0022]在第三方面，本发明提供了一种高通量测序方法，所述方法采用第二方面所述的方法进行DNA文库构建。
[0023]在本发明的方法中，适合的环状DNA与所构建的目标DNA文库乃至后续测序步骤中所使用的测序仪有关，可根据需要选用不同大小的环状DNA，只要所述环状DNA与所构建的目标DNA文库能够有效分离即可。例如，Illumina和1n torrent测序仪只能测较短的DNA文库(50?100nt)，于是适合的环状DNA大小一般应在1.5kb以上，而PacB1和Min1N测序仪主要测序较长的DNA文库(3kb?30kb)，因此适合的环状DNA大小一般应在
2.5kb以下或40kb以上。最常见、也最容易制备的高质量环状DNA是细菌的质粒，其大小通常为1.5kb?9kb。也可用线粒体基因组(约17kb)和细菌基因组(一般I?1Mb)。
[0024]本发明的有益效果在于:
[0025](I)可有效提取微量、已降解成小片段的DNA，从而使得之后DNA建库和测序能够顺利进行，最终获取其序列信息。
[0026](2)即使样品中混有大量微生物(或其他异种生物)基因组污染，也可不受干扰地进行建库和测序，这对处理一些已受污染的样品(如病人血液、法医应用中埋藏于野外的高度腐烂的尸体等)特别有用。
[0027](3)可极大降低对实验环境洁净度和操作人员熟练程度的要求。即便实验环境中存在其他生物污染(如空气中漂浮的细菌、真菌孢子、植物花粉等)，待测微量DNA也可不受影响地建库和测序。
【附图说明】
[0028]通过以下参照附图对本发明实施例的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优点将更为清楚，在附图中:
[0029]图1显示超微量的、DNA已降解成30-40bp的人细胞基因组DNA样品进行建库的结果。图1A中所用凝胶电泳为2.5%琼脂糖凝胶电泳，图1B中所用凝胶电泳为12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(高分辨率解析小片段核酸)，在图1A和B中泳道1-4分别为lng, 10pg, 1pg, 3pg已降解的人细胞基因组DNA根据本发明的方法进行DNA提取和建库的结果。*(星号)标明所加入的环状质粒DNA，黑色三角形标明接头二聚体所在位置，黑色箭头标明待测DNA片段连接接头后(即有效测序文库)的位置；泳道5和6分别是对比例I和2中建库的结果；M1和M2分别为两种DNA分子量标准品。
[0030]图2显示对本发明方法耐受微生物污染的评估。Ing已降解成30-40bp的人细胞基因组DNA按照本发明方法进行DNA提取和建库，泳道I是没有微生物DNA污染的样品进行建库的结果，泳道2是加入10 μ g大肠杆菌基因组DNA污染后进行建库的结果，星号、黑色三角形、黑色箭头的含义同图1。
【具体实施方式】
[0031]本发明采用加入环状DNA的方法帮助提取超微量、已降解成小片段的目标DNA，并使用直接建库的方法进行DNA建库，其中环状DNA的长度需与待测已降解的DNA片段的长度有明显区别。
[0032]优选地，加入的环状DNA为高纯度的细菌质粒DNA。更优选