专利名称：一种从动物组织中提取神经节苷脂的方法
技术领域：
本发明涉及一种从动物脑组织及其他组织中提取以神经节苷脂为主要成分的糖脂类物质的方法。
上述文献所报道的方法以牛脑为主要原料，以氯仿和甲醇为提取剂，提取粗品后再进行纯化和精制；而上述专利所公开的技术以乙醇和石油醚为提取剂，提取粗品后再进行纯化和精制。上述文献和专利所述的方法所采用的提取过程和提取剂均没有顾及神经节苷脂是一种强极性的酸性化合物，它带有很强的负性电荷这样一个基本特点，因此，提取率较低，所获得的产品的纯度较差，且胆固醇、中性脂质和其他杂质的含量较高，必须经过反复精制才能够符合食用和药用的要求，生产成本较高，不能满足人们日常生活、医药和保健领域的需求。
在神经节苷脂中，鞘糖脂的寡糖链上含有唾液酸，表征它是一种强极性的酸性化合物，它带有很强的负性电荷；在生物膜结构中，唾液酸及其丝氨酸构成了极性头(区)，其结构内部既有亲水区又有疏水区。
为此，本发明选用偶极矩在1.84Debye～1.68Debye之间的极性有机溶剂作为提取剂，这些溶剂的极性度使神经节苷脂能够稳定地溶解在其中，而溶剂的非极性部分，破坏膜结构中的疏水区，从而加速神经节苷脂的增溶。
其次，本发明根据提取系统中，液—固，液—液物料化学结构特性，选用溶解度参数为7.0～9.2或溶剂强度∑°为0.01～0.42的非极性溶剂，对所获得的含有神经节昔脂和其他杂质的极性溶剂进行反相萃取，使神经节苷脂在反相萃取的多元分配分层中达到理想的效果。
本发明需要对生物材料进行预处理。酮类化合物，特别是丙酮，是生物材料破膜(壁)剂，它能破坏双层脂质结构，使完整细胞破损，穿孔，从而加速细胞内含物的溶出，使提取时间和次数减少。丙酮还能除去生物材料中的胆固醇(脑组织中)，中性脂质(胎盘中)，而甲乙酮能除去胆汁酸(胆组织中)。生物材料提取过程中，常因某些酶类的酶解作用，而使目的产物受到破坏，而丙酮的作用，常能抑制这些酶的活性，使提取工作顺利进行。
本发明所述的方法依次包括如下步骤(1)生物材料的预处理将新鲜的或经低温干燥的或经自溶的生物材料，经绞碎，匀浆，粉碎后用酮类物质及其混合物浸渍处理，处理温度一般为5℃～25℃，浸渍时间为4～34小时，过滤，收集滤饼。浸渍处理次数为3～6次，酮类物质用量为生物材料体积的1.5～4倍，优选的酮类物质为丙酮或甲乙酮，所说的生物材料包括动物脑组织、胎盘或血清。
(2)极性溶剂提取在步骤(1)的滤饼中加入极性溶剂进行提取，搅拌，过滤，收集滤液；极性溶剂用量为滤饼的5～10倍，提取次数为1～3次，提取温度为10℃～60℃，推荐温度为20℃～35℃；所说的极性溶剂为偶极矩在1.68Debye～1.84Debye之间的极性溶剂，所述溶剂的极性度使神经节苷脂能够稳定地溶解在其中，而溶剂的非极性部分，破坏膜质膜结构中的疏水区，从而加速神经节苷脂的增溶；优选的极性溶剂包括水、甲醇、四氢呋喃或二甲基甲酰胺等中的一种或一种以上，提取时间为1～4小时；按照本发明，如以水和上述其他极性溶剂的混合物作为提取剂，其比例为水/其他极性溶剂＝0.5～6。
(3)反相萃取在步骤(2)的滤液中加入非极性溶剂，经搅拌、静置、分相，使滤液中的神经节苷脂分配在极性溶剂相中，杂质分配在非极性溶剂相中，从而确保了极性溶剂相中神经节苷脂的纯度。下层极性溶剂相经减压浓缩，冷冻干燥得成品神经节苷脂；非极性溶剂的加入量为滤液混合物重量的0.5～2.5倍，进行多元分配的次数为1～3次，多元分配的温度为10℃～35℃，推荐温度为25℃～30℃；按照本发明，步骤(2)的极性溶剂提取后所获得的液固混合物，可直接加入非极性溶剂，进行液-液，液-固多元分配，然后进行过滤，获得滤液，静置分层，下层极性溶剂相经减压浓缩，冷冻干燥得成品神经节苷脂；减压浓缩温度控制在40℃～60℃，推荐温度在42℃～50℃，时间控制在2～8小时，推荐时间控制在3～5小时左右。时间过长会造成神经节苷脂中重要基团唾液酸的分解，或造成产品氧化破坏；所说的非极性溶剂的溶解度参数为7.0～9.2或溶剂强度∑°为0.01～0.42，优选的为正己烷、庚烷、氯仿、乙醚、石油醚、甲基戊烷或汽油中的一种或一种以上。
采用上述方法所获得的神经节苷脂，其纯度可达81％，且胆固醇、中性脂质、的含量较低。
可采用文献Svennerholm.L.Methods in Engymology(VI)453.1963对本发明的产品进行测定，按常规测定其结构中唾液酸的含量。
由上述公开的技术方案可见，本发明的的优点是十分明显的(1)采用生物材料预处理法，将生物材料特别是脑组织中的大量胆固醇，中性脂质，用丙酮处理除去，为后续工艺带来方便，所得神经节苷脂的产量和纯度均为提高；(2)采用生物材料预处理，有利于生物材料中细胞内含物增溶释放，降低了提取剂用量，节约提取时间，减少提取次数；(3)采用多种溶剂配伍，能找到工艺上最佳热力学条件，理论和实践上都有较好效果。
综上所述，本发明的方法，生产工艺简单，适宜于规模化生产，产品纯度高，能够满足食用和药用的要求。
实施例1将100克猪脑组织用绞肉机绞碎，匀浆，在冷处用丙酮浸渍三次，第一次用3倍量，第二次用2.5倍量，第三次用1.5倍量，每次24小时，用细布或压滤机过滤；上述处理过的猪脑组织，加入200ml水，1200ml四氢呋喃，充分搅拌，离心，残渣用300ml四氢呋喃，重复提取一次，合并二次提取液，加入450ml石油醚，进行多元分配，分层后得下层极性溶剂相，上层非极性溶剂相用100ml的水重复提取一次，合并下层极性溶剂相，过滤，45℃减压浓缩，冷冻干燥得成品，色灰白，能溶于水，溶于氯仿——甲醇溶液(2∶1，体积比)，纯度为81％。
实施例2将500克猪脑组织，绞碎匀浆，60℃热风吹干，磨成细粉(水分小于8％)，取上述脑干粉，用丙酮浸泡5小时，重复5次，过滤，在滤饼中按1∶5的比例加入80％的乙醇水溶液，充分搅拌1.5小时，接着按1∶4加入正己烷，充分搅拌1.5小时，静止分层后，分得下层乙醇溶液，上层非极性相用500ml水重复抽提，合并醇和水提取液，40℃减压浓缩，冷冻干燥得成品，白色或灰白色，纯度79.0％。
实施例31公斤牛胎盘，绞碎，匀浆，用实施例1方法进行丙酮处理后加入2L蒸馏水，12L四氢呋喃，充分搅动1.5小时，离心，残渣用3L四氢呋喃重复提取一次。合并提取液，加入4.5L正己烷，进行多元分配1.5小时，分层后得下层极性溶剂相，上层非极性溶剂相用1L蒸馏水提取一次，合并两次水相，过滤，45℃减压浓缩，冷冻干燥。成品白色或灰白色，纯度80.5％。
实施例4将100克猪脑组织用绞肉机绞碎，匀浆，在冷处用丙酮浸渍24小时，然后加入1400二甲基甲酰胺，充分搅拌，离心，加入450ml石油醚，进行多元分配，分层后得下层极性溶剂相，上层非极性溶剂相用100ml的水重复提取一次，合并下层极性溶剂相，过滤，45℃减压浓缩，冷冻干燥得成品，色灰白，能溶于水，溶于氯仿——甲醇溶液(2∶1，体积比)，纯度为80.5％。
实施例5～9采用与实施例1相同的提取过程，并分别以庚烷、氯仿、乙醚、甲基戊烷和汽油代替石油醚，产品的纯度分别为80.5％、81.5％、80.0％、78.0％和79.0％。
权利要求
1.一种从动物组织中提取神经节苷脂的方法，其特征在于，该方法依次包括如下步骤(1)生物材料的预处理将生物材料用丙酮或甲乙酮及其混合物浸渍处理，过滤，收集滤饼，所说的生物材料包括动物脑组织、胎盘或血清；(2)极性溶剂提取在步骤(1)的滤饼中加入极性溶剂进行提取，过滤，收集滤液；提取温度为10℃～60℃；所说的极性溶剂为偶极矩在1.68Debye～1.84Debye之间的极性溶剂，提取时间为1～4小时；(3)反相萃取在步骤(2)的滤液中加入非极性溶剂，分相后下层极性溶剂相经减压浓缩，冷冻干燥得成品神经节苷脂；非极性溶剂的加入量为滤液混合物重量的0.5～2.5倍，多元分配的温度为10℃～35℃；减压浓缩温度为40℃～60℃，时间为2～8小时；所说的非极性溶剂的溶解度参数为7.0～9.2或溶剂强度∑°为0.01～0.42。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，生物材料预处理温度为5℃～25℃，浸渍时间为4～34小时，酮类物质用量为生物材料体积的1.5～4倍，极性溶剂提取的温度为20℃～35℃，多元分配的温度为25℃～30℃，减压浓缩温度为42℃～50℃，时间为3～5小时。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，极性溶剂为水、甲醇、四氢呋喃或二甲基甲酰胺中的一种或一种以上，非极性溶剂为正己烷、庚烷、氯仿、乙醚、石油醚、甲基戊烷或汽油中的一种或一种以上。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于，以水和上述其他极性溶剂的混合物作为提取剂，其比例为水/其他极性溶剂＝0.5～6。
5.如权利要求1～4所述方法，其特征在于，步骤(2)的极性溶剂提取后所获得的液固混合物，直接加入非极性溶剂，然后进行过滤，获得滤液，静置分层，下层极性溶剂相经减压浓缩，冷冻干燥得成品神经节苷脂。
全文摘要
本发明公开了一种从动物组织中提取神经节苷脂的方法。该方法采用一种或多种与神经节苷脂的极性相匹配的极性溶剂，可大大提高神经节苷脂的提取效率，并采用反相萃取的方法去除提取物中的杂质，可提高产品品位，降低生产成本。采用本发明的方法所获得的神经节苷脂，其纯度可达81％，且胆固醇、中性脂质、的含量较低，本发明生产工艺简单，适宜于规模化生产，产品纯度高，能够满足食用和药用的要求。
文档编号C07H15/00GK1400216SQ0112634
公开日2003年3月5日 申请日期2001年7月26日 优先权日2001年7月26日
发明者冯万祥, 吴同新 申请人:上海绿谷伟业生态工程有限公司