专利名称：：动物关节软骨组织总rna提取方法
技术领域：
：本发明涉及一种富含蛋白多糖的RNA提取方法，特别涉及一种动物关节软骨组织总RNA提取方法。
背景技术：
：各种关节疾病和脊柱关节的疾病的治疗一直是医学界面临的难题，国内外正在开始尝试的基因治疗有望获得该领域治疗的突破。从基因水平对软骨组织进行研究意义重大，而从软骨组织中提取高质量的RM是各种基因表达研究的关节软骨基质多，细胞少，细胞成分只占20%,软骨基质的主要成分是II型胶原，由于II型胶原中富含羟赖氨酸，并且羟赖氨酸的羟基几乎全部和糖结合，因而糖化率高，*量约为10%,因此软骨基质主要成分是蛋白多糖。关节软骨属于细胞含量少的组织，组织RNA含量低，并且多糖的理化性质与核糖核酸RNA非常相似，在沉淀RNA时，蛋白多糖和RNA—块无区分的沉淀下来，产生富含多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液，这样的RNA由于蛋白多糖的干扰无法进行后续的各种分子生物学试验。在去除多糖的同时RNA也被带走，造成RNA的大量丢失，因jtb^软骨中提取高质、足量的RNA非常困难。由于软骨组织的特殊结构，目前尚无有效的方法来解决这一难题，基于酸酚/胍盐原理的总RM抽提方法是动物组织、细胞核酸分离的主要方法，如一步法、trizol法等，但基于酸酚/胍盐原理的方法不适于富含多糖的动物组织，因为该种方法不能区分理化性质相似的多聚核糖和蛋白多糖，在进行RNA沉淀的时候，蛋白多糖和RNA—起沉淀下来，而去除蛋白多糖的步骤也是RNA损失的步骤。plantRNAout法是基于CTAB裂解法的总RNA提取方法，其优点是操作筒便、易行，含CTAB的裂解液是用于富含多糖和多酚的植物总RNA抽提的首选细胞裂解方法，可以有效的分离植物组织中的多糖和RNA，但通过多次实验证明，该方法用于抽提新西兰白兔关节软骨组织的总RNA时引入DAN污染。因此，我们试验证明用一步法、trizol法、animaRNAout法、植物RNA提取法等成熟的RNA提取方法都不能获得高质量总RNA，采用经典的去除多糖的方法如高盐、低醇沉淀法都不能去除大量的多糖。
发明内容本发明的目的是提供一种动物关节软骨组织总RNA提取方法，它适用于含蛋白多糖的RNA难提组织的小量总RNA提取，采用本发明方法提取的动物关节软骨组织总RNA的收率高，并且质量好、纯度高、完整性好，可以满足分子生物学研究应用。本发明方法有以下步骤(1)取动物关节软骨组织，立即投入液氮中研磨至粉末状，每50重量份的关节软骨组织加入l体积变性液，0.007体积的(3-巯基乙醇，匀浆至无明显组织块；(2)将勾浆液置于冰水浴上，加酸性水饱和酚，摇匀，加醋酸钠，氯仿、异戊醇混合液，置于冰水浴上15min;(3)4。C下，离心，取上清液，加入氯仿、异戊醇混合液，离心取上清加入异丙醇，-20。C下沉淀30min,离心30分钟，得到凝胶状RNA和蛋白多糖混合沉淀，加入无RNA酶水，溶解沉淀得到胶状溶液；(4)取胶状溶液用plantRNAout试剂盒的R駄纟是取步骤得到总RNA沉淀，取沉淀，乙醇洗涤二次后用无RNA酶水溶解沉淀即得关节软骨组织总RNA溶液。本发明所述的重量与体积的计量单位，采用克与毫升或千克与升或微克与微升等。通常细胞中约75%的RNA酶存在于胞液中，当细胞裂解后，RNA酶会释i文出来，在没有有效的抑制措施下，RNA酶会迅速降解RNA。一步法所用的裂解液主要成分为异^5危氰酸胍，它是一种强烈的蛋白质变性剂，能有效的抑制RNase活性，使RNase变性，裂解液中加入的P-巯基乙醇也是RNase的强烈抑制剂，联合应用可有效防止RNA降解。由于动物RNA提取方法基于酸性环境，而植物RNA提取方法是基于碱性环境。本发明将动物RNA提取方法和植物RM提取方法两种方法结合，并根据关节软骨组织总MA的理化性质做进一步的改进，使得提取的动物关节软骨组织总RNA的收率高，完整性好。原因是一步法提取的总RNA沉淀非常彻底，RNA损失少，得率是最高的，而且一步法所用的试济对RNA酶的抑制也是可靠的。用一步法分离DNA和RNA，在移取上清的步骤尽量多取，虽然在已取上清夜中引入了少量的中间层蛋白质，但在后续的氯仿抽提过程可以去除。加入异丙醇后要在-20°沉淀30分钟，沉淀离心时间也延长到3O分钟，都能有效的增加RNA的得率，虽然这两个步骤增加了蛋白多糖的污染，但在后续的plantRNAout提取过程中可以有效的去除多糖。本发明适用于小量关节软骨组织或其他部位软骨组织的RNA提取，并且有方法简单、经济、适用的优点适合于分子生物学研究应用。采用本发明方法提取的动物关节软骨组织总RNA的收得率、质量和純度均高于动物RNA提取方法和植物RNA提:取方法。图1为一步法提取RNA电泳图2为Trizol法^是取RNA电泳图3为animalRNAout法提取RNA电泳图4为plantRNAout法提取总RNA电泳图5为酶消化实验电泳图6为本发明方法提取总RNA电泳图7为用所提取总RNA经过不同循环数LD-PCR合成的双链cDAN电泳图。具体实施例方式实施例采用的试剂和设备本发明所述试剂均采用市售的分析纯试剂。1.无RNase的DEPC水双蒸水中加0.1%的DEPC摇勻后置室温内过夜，再进行高压灭菌处理即可使用。2.变性液秤异硫氰酸胍23.6320g,柠檬酸三钠G.3676g,十二烷基肌氨酸钠G.25g,加入25ml高压灭菌三蒸水，定容到50ml。3.pH为4.0的2mol/L醋酸钠50ml:无水醋酸钠8.28g，三蒸水30ml溶解，水醋酸调pH值到4.0加水定容至50ml。4.氯仿、异戊醇混合液氯仿异戊醇为49:1;吸耳又氯仿49ml,加入异戊醇lml混匀；5.75%乙醇100ml:耳又新开弁瓦乙醇75m1,加入进行了无RNase处理的弁瓦子，加入无RNase水25ml;6.plantRNAout试剂盒由绵羊天择基因公司生产的同名产品；7.PH为4.5的酸性水饱和酚由上海生工公司生产的产品；8.AJ-30I型低温超速离心机(Beckman，USA);9.Chemilmager5500型凝月交成i"象仪(AlphaInnotech,USA);10.DU-800型核酸/蛋白检测仪(Beckman,USA);实施例1关节软骨组织总RNA的提取組织匀浆取新西兰白兔关节软骨组织后立即投入液氮中，按每50mg新西兰白兔关节软骨组织加入变性液lml中裂解，7^1p-巯基乙醇，匀浆。将匀浆液分装入无酶无菌(无RNase)1.5ml离心管，每管0.5ml，置于冰水浴上，每管加500^1酸性水饱和酚，用力摇匀，每管加50|_U2mol/LpH为4.O的醋酸钠溶液，lOOpl氯仿异戊醇(49:1)混合液，用力摇匀，置于冰水浴上15min。于4。C，12,000g，离心10min，取上清加入无RNasel.5ml离心管，每管加500(xl氯仿异戊醇(49:1)混合液，用力摇匀。于4。C,12，000g,离心5min,取上清加入无RNase1.5ml离心管。每管加等体积异丙醇，用力摇匀，置于-20。C沉淀30min。于4。C，14，000g，离心30min，小心将上清吸出并抛弃。加入20fxl用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的无RM酶水无RNA酶水，振荡溶解沉淀，得到沉淀溶解后的胶状溶液，将胶状溶液合并于一个无RNasel.5ml离心管。加入lml溶液A,充分混匀后加入0.3ml溶液B和0.2ml氯仿，充分混匀。于4。C,15,000g，离心5min，小心将上清吸出转移到另一个1.5ml离心管。加入0.3ml溶液C和0.2ml氯仿，充分混匀。于4°C，15,000g,离心3min，小心将上清吸出转移到另一个1.5ml离心管。加入1/2体积溶液D，充分混匀。于4°C，15,OOOg,离心30min。小心吸弃上清液，加入lml75%乙醇，轻摇离心管洗沉淀30秒。于4'C，15,OOOg,离心3min。小心吸弃上清液，加入lml75%乙醇，轻摇离心管洗沉淀30秒。于4°C，15，OOOg,离心3min。简单离心，将残存乙醇聚于管低，小心用移液器吸弃。室温干燥5分钟，加入适量无RNA酶水溶解沉淀。实施例2各种试验方法的比较见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结论一步法、Trizol法和animalRNAout法的共同特点是提取物中含有大量白色不溶解沉淀，为蛋白多糖，所得RNA纯度差，得率低，增加抽提次数仍不能去除蛋白多糖；植物RNA提取法为植物RNA提取方法的尝试，多次试验结果显示有基因组DNA污染。本发明方法获得高质量、高纯度、完整性好、收率较高的RNA,完全满足后续分子生物学试验要求。实施例3总RNA的逆转录及LD-PCR扩增采用美国CL0NTECH/厶司的SMARTPCRcDNASynthesisKit进行逆转录。用LD-PCR方法，用本发明方法提取的新西兰白兔关节软骨总RNA为模板，利用引物SMARTIIAOligonucleotide和3'SMARTCDSPrimerIIA在反转录酶作用下首先合成两端带有接头的cDNA,通过引物5PCRPrimerIIA继续合成并扩增双链cDNA。实验在PTC-200型PCR仪上进行15、18、21个循环，并确定17个循环为最优循环数字。提取的总RNA的LD-PCR结果见图7，由左至右依次为Marker、15、18、21循环，因此，用本发明方法提耳又的总RNA获得LD-PCR的成功。结论LD-PCR对RNA质量的要求高于普通的逆转录PCR，将分本发明方法所获得的总RNA进行LD-PCR获得成功说明总RNA质量好，完全满足分子生物学实验要求。权利要求1.一种动物关节软骨组织总RNA提取方法，其特征在于该方法有以下步骤(1)取动物关节软骨组织，立即投入液氮中研磨至粉末状，每50重量份的关节软骨组织加入1体积变性液，0.007体积的β-巯基乙醇，匀浆至无明显组织块；(2)将匀浆液置于冰水浴上，加酸性水饱和酚，摇匀，加醋酸钠，氯仿、异戊醇混合液，置于冰水浴上15min；(3)4℃下，离心，取上清液，加入氯仿、异戊醇混合液，离心取上清加入异丙醇，-20℃下沉淀30min，离心30分钟，得到凝胶状RNA和蛋白多糖混合沉淀，加入无RNA酶水，溶解沉淀得到胶状溶液；(4)取胶状溶液用plantRNAout试剂盒的RNA提取步骤得到总RNA沉淀，取沉淀，乙醇洗涤二次后用无RNA酶水溶解沉淀即得关节软骨组织总RNA溶液。2.根据权利要求1所述动物关节软骨组织总RNA提取方法，其特征在于步骤(1)中所述的变性液的组成为秤异碌u氰酸胍23.6320重量份柠檬酸三钠Q.3676重量份十二烷基肌氨酸钠G.25重量份加入25重量份三蒸水，定容至50体积。3.根据权利要求1所述动物关节软骨组织总RNA提取方法，其特征在于步骤(2)、(3)中所述的氯仿、异戊醇混合液中的氯仿异戊醇为49:1。4.根据权利要求1所述动物关节软骨组织总RNA提取方法，其特征在于步骤(2)中所述的醋酸钠溶液的浓度为2mol/L。全文摘要本发明涉及一种动物关节软骨组织总RNA提取方法，该方法有以下步骤(1)取动物关节软骨组织，研磨，加入变性液，β-巯基乙醇，匀浆；(2)冰水浴下，加酸性水饱和酚，摇匀，加醋酸钠，氯仿、异戊醇混合液，冰水浴上15min；(3)4℃下，离心，取上清液，加氯仿、异戊醇混合液，离心取上清，加异丙醇，-20℃下沉淀，离心，得到凝胶状RNA和蛋白多糖混合沉淀，加无RNA酶水，溶解得胶状溶液；(4)取胶状溶液用plantRNAout试剂盒的RNA提取步骤得到总RNA沉淀，取沉淀，乙醇洗涤后用无RNA酶水溶解沉淀，即得关节软骨组织总RNA溶液。采用本发明方法提取的动物关节软骨组织总RNA的收率高，并且纯度高、质量、完整性好，可以满足分子生物学研究应用。文档编号C07H21/02GK101182343SQ20071009316公开日2008年5月21日申请日期2007年12月18日优先权日2007年12月18日发明者刘玉刚,初同伟,跃周,欧娟娟申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院