一种无损伤提取中华鲟dna的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种无损伤提取中华鋳DNA的方法。
【背景技术】
[0002]中华鋳WcijOeftser sinensis是一种古老的大型海河回游性鱼类，曾经分布于我国的长江和珠江河流，由于近年来过度捕捞、环境污染、水利工程建设等人为原因造成了中华鋳的数量急剧下降，现在珠江流域的中华鋳已经绝迹，中华鋳已成为极度濒危的物种。
[0003]然而，进行中华鋳的遗传多样性研究和保护需要大量的中华鋳样本进行生物分析，进行生物分析的基础往往是提取DNA和RNA进行研究。传统的提取中华鋳DNA的方法是从肌肉、鳍或者血液内提取，这些提取DNA的方法会对中华鋳造成很严重的损伤，影响中华鋳的后期育种工作，甚至会对幼小的中华鋳造成死亡，由此可见，开展一种无损伤提取中华鋳DNA的方法势在必行。
[0004]无损伤提取DNA是指在不伤害动物本身的情况下，通过收集脱落的毛发、皮肤、羽毛、粪便、尿液、脱落的鱼鳞等从中提取DNA的过程。目前关于鱼类无损伤提取DNA的报道仅有几篇，关于中华鋳无损伤提取DNA尚未报道。宋君等报道了一种鱼类DNA非损伤检测方法，宋君等用试剂盒对鲫鱼粘液提取DNA，结果证明了从鱼类粘液提取的DNA浓度和从尾鳍和鳞片提取的DNA浓度相差不大。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供了一种操作简单快速的提取中华鋳DNA的方法，实现无损伤提取中华鋳DNA。
[0006]一种无损伤提取中华鋳DNA的方法，所述方法包括如下步骤:
1)获取样本:从中华鋳身上刮取粘液，置0-4°C中保存；
2)样本的处理:把所述步骤1)的粘液离心，除去上清液，得到离心后的粘液；
3)裂解细胞:把裂解液和蛋白酶K加入所述步骤2)离心后的粘液，50-60°C下水浴
0.5-1.5 h，得到裂解细胞后的粘液；
4)沉淀蛋白质:把饱和酚放入所述步骤2)裂解细胞后的粘液中，震荡20分钟，离心得到上清液，然后在上清液中加入氯仿，震荡18-25分钟，离心得到除去蛋白质的上清液；
饱和酚的作用是使蛋白质变性，抑制DNA酶的作用，氯仿的作用是除去饱和酚，氯仿可以和饱和酚混合，但是不会溶于水，DNA溶于水中，饱和酚溶于氯仿中，氯仿和水是分开的，使DNA中不含有饱和酚；
5)沉淀DNA:将-28°C至_20°C的异丙醇加入所述步骤3)除去蛋白质的上清液，剧烈震荡，离心除去上清液，得到沉淀为DNA ;
异丙醇溶于水，但是不和DNA发生任何化学反应，并且可以夺取DNA中的水，使DNA脱水沉淀下来；
6)洗涤DNA:将70%的乙醇加入所述步骤5)沉淀中，离心除去上清液，洗涤沉淀物2-4次，得到洗涤后的DNA;
第五步的DNA沉淀会含有盐离子，70%乙醇的作用是除去盐离子；
7)获取DNA:加入超纯水至所述步骤6)洗涤后的DNA中，置于0-4°C下保存；完成中华鋳DNA的提取。
[0007]所述步骤1)从中华鋳身上刮取粘液的方向为顺着从中华鋳的头到尾的方向刮取，防止对中华鋳造成损伤。
[0008]所述步骤3)裂解液的配置为 0.05M EDTA、5%SDS、0.01M Tris_Hcl、0.3M 乙酸钠，所述蛋白酶1^浓度为20mg/ml。
[0009]所述步骤3)加入的裂解液和蛋白酶K的体积比为裂解液:蛋白酶K:尚心后的粘液=40:2:15。
[0010]所述步骤3)把裂解液和蛋白酶K加入所述步骤2)离心后的粘液，56°C下水浴lh，56°C是蛋白酶K的最适温度，水浴lh溶解蛋白质和裂解细胞。
[0011]所述步骤2)、步骤4)、步骤5)和步骤6)中的离心条件均为温度0-4°C，转速为12000转/分钟，离心10-20分钟，低温离心的目的是防止在提取的过程中DNA降解。
[0012]本发明提供本发明的目的是提供了一种操作简单快速的提取中华鋳DNA的方法，有益效果如下:
1、本发明建立了一套完整的提取中华鋳粘液的方法，本发明可以快速有效的提取中华鋳DNA，提取的DNA条带清晰，无拖尾现象，说明提取的DNA质量高，不收蛋白质的污染，结果稳定可靠；
2、本发明提供的提取中华鋳粘液DNA方法不会对中华鋳造成任何损伤；
3、本发明提供的提取中华鋳粘液DNA方法根据粘液中的DNA易提取和易降解的特点，省去了苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混合液和氯仿:异戊醇(24:1)混合液，比传统的酚-氯仿法更为简单快速，节省了 DNA提取时间，从而有效防止DNA氧化造成的损失；
4、本发明提供的提取中华鋳粘液DNA方法费用比试剂盒法和酚氯仿法较低。
【附图说明】
[0013]图1:本发明所提取的DNA条带示意图；
图2:本发明所提取的DNA为模板用微卫星引物进行检测结果示意图。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
[0015]实施例1
一种无损伤提取中华鋳DNA的方法，所述方法包括如下步骤:
1)获取样本:在湖北宜昌中华鋳研究所养殖池内取6条中华鋳，把中华鋳从水中捞起，用手指在中华鋳体表轻轻的刮，刮的方向为从头到尾的方向，把刮到手指上的粘液放入离心管中，等取到200ul后，把装有粘液的离心管放入0°C下，防止DNA降解；
2)样本的处理:把所述步骤1)的粘液离心，除去上清液，得到离心后的粘液；
3)裂解细胞:把裂解液和蛋白酶K加入所述步骤2)离心后的粘液，56°C下水浴lh，使其快速的裂解，得到裂解细胞后的粘液；
4)沉淀蛋白质:把饱和酚放入所述步骤2)裂解细胞后的粘液中，震荡20分钟，离心得到上清液，把上清液用减掉剪掉尖头的枪头移入另一个干净的离心管内，然后在上清液中加入氯仿，震荡20分钟，离心，把上清液用减掉剪掉尖头的枪头移入另一个干净的离心管内，注意不要吸到白色的隔离层，得到除去蛋白质的上清液；
5)沉淀DNA:将_20°C的异丙醇加入所述步骤3)除去蛋白质的上清液，剧烈震荡，离心除去上清液，得到沉淀为DNA ;
6)洗涤DNA:将70%的乙醇加入所述步骤5)沉淀中，离心除去上清液，得到洗涤后的
DNA ；
7)获取DNA:加入超纯水50 ul至所述步骤6)洗涤后的DNA中，置于4°C下保存； 完成中华鋳DNA的提取。
[0016]所述步骤3)裂解液的配置为 0.05M EDTA、5%SDS、0.01M Tris_Hcl、0.3M 乙酸钠，所述蛋白酶1^浓度为20mg/ml。
[0017]所述步骤3)加入的裂解液和蛋白酶K的体积比为裂解液:蛋白酶K:尚心后的粘液=40:2:15。
[0018]所述步骤2)、步骤4)、步骤5)和步骤6)中的离心条件均为温度4°C，转速为12000转/分钟，离心10分钟。
[0019]实施例2 DNA的检测
1、电泳检测:取提取的5ulDNA在1%的琼脂糖凝胶电泳中检测，120V电压20分钟，经凝胶成像分析系统观察点样点附近是否存在DNA条带，结果如图1所示，在点样点附近存在白色的DNA条带，并且DNA条带清晰，无拖尾的现象，说明DNA提取较好。
[0020]2、PCR检测:以提取的DNA为模板用微卫星引物进行检测。PCR扩增体系为:PCR反应液12.5ul、上下游引物各lul、超纯水9.5ul、DNA模板lul。PCR反应程序为:95°C预变性2min ； 95°C变性30s，退火温度复性30s，72°C延伸30s，35个循环；72°C延伸lOmin ；4°C保存。把PCR扩增产物放入1%的琼脂糖凝胶电泳中检测，120V电压20分钟，经凝胶成像分析系统观察呈现引物所要求的扩增条带，结果如图2所示，说明DNA提取较好，可用于分子实验研究。
上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种无损伤提取中华鋳DNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: 1)获取样本:从中华鋳身上刮取粘液，置0-4°C中保存； 2)样本的处理:把所述步骤1)的粘液离心，除去上清液，得到离心后的粘液； 3)裂解细胞:把裂解液和蛋白酶K加入所述步骤2)离心后的粘液，50-60°C下水浴0.5-1.5 h，得到裂解细胞后的粘液； 4)沉淀蛋白质:把饱和酚放入所述步骤2)裂解细胞后的粘液中，震荡20分钟，离心得到上清液，然后在上清液中加入氯仿，震荡18-25分钟，离心得到除去蛋白质的上清液； 5)沉淀DNA:将-28°C至_20°C的异丙醇加入所述步骤3)除去蛋白质的上清液，剧烈震荡，离心除去上清液，得到沉淀为DNA ; 6)洗涤DNA:将70%的乙醇加入所述步骤5)沉淀中，离心除去上清液，洗涤沉淀物2-4次，得到洗涤后的DNA; 7)获取DNA:加入超纯水至所述步骤6)洗涤后的DNA中，置于0_4°C下保存； 完成中华鋳DNA的提取。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤1)从中华鋳身上刮取粘液的方向为顺着从中华鋳的头到尾的方向刮取。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤3)裂解液的配置为0.05M EDTA、5%SDS、0.01M Tris-Hcl、0.3M 乙酸钠，所述蛋白酶 K 浓度为 20mg/ml。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤3)加入的裂解液和蛋白酶K的体积比为裂解液:蛋白酶K:离心后的粘液=40:2:15。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤3)把裂解液和蛋白酶K加入所述步骤2)离心后的粘液，56°C下水浴lh。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤2)、步骤4)、步骤5)和步骤6)中的离心条件均为温度0-4°C，转速为12000转/分钟，离心10-20分钟。
【专利摘要】本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种无损伤提取中华鲟DNA的方法。所述方法包括获取样本、样本的处理、裂解细胞、沉淀蛋白质、沉淀DNA、洗涤DNA、获取DNA。本发明建立了一套完整的提取中华鲟粘液的方法，本发明可以快速有效的提取中华鲟DNA，提取的DNA条带清晰，无拖尾现象，说明提取的DNA质量高，不收蛋白质的污染，结果稳定可靠。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105400775
【申请号】CN201511013326
【发明人】胡亚成, 杜合军, 刘雪清, 肖衎, 刘娟娟, 陈冬娟, 王彬忠, 赵珣
【申请人】中国长江三峡集团公司中华鲟研究所
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月31日