一种简便的sds裂解制备细菌基因组dna悬液的方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，特别涉及一种简便的SDS裂解制备细菌基因组DNA悬液的方法及应用。
【背景技术】
[0002]细菌分子鉴定技术中，16S rDNA序列的PCR扩增鉴定已经是十分常用的手段。在实验室的实际操作中，用于PCR扩增的模板DNA来源各异，比如试剂盒提取纯化的DNA，或者是直接蘸取固体培养基上的单菌落菌体。但是前者的缺点是试剂繁多、步骤复杂，后者的缺点是平行组之间挑取的菌量不稳定、未知细菌能否自裂解释放DNA。
[0003]因此，寻找一种比较简单快速、环境友好、同时能确保细菌裂解释放出基因组DNA模板的制备方法，有利于提高细菌16S rDNA序列PCR的效率。
【发明内容】
[0004]为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种简便的SDS裂解制备细菌基因组DNA悬液的方法。
[0005]本发明的另一目的在于提供上述制备细菌基因组DNA悬液的方法PCR扩增鉴定(特别是16S rDNA序列的PCR扩增鉴定)中的应用。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0007]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:一种简便的SDS裂解制备细菌基因组DNA悬液的方法，其包括以下步骤:
[0008](1)细菌培养:用试管装入已灭菌的液体培养基1000mL，接种细菌，经过夜培养12?16小时；
[0009](2)菌体收集:吸取1000 μ L细菌悬液12000rpm离心1分钟沉淀菌体，并去除上清液；
[0010](3)菌体的裂解:往菌体沉淀加入10 μ L 0.1-10%的SDS (十二烷基硫酸钠)溶液，混匀后用涡旋振荡器震荡5分钟；
[0011](4)稀释裂解液:加入490 μ L的无菌水或者IXΤΕ溶液，吹打混匀，稍作离心，即可得到浓度适当，可直接用于PCR等基因操作的细菌基因组DNA模板悬液。
[0012]步骤(1)中所述的细菌为兼性厌氧菌或好氧细菌。
[0013]步骤⑴中所述的细菌为兼性厌氧菌时，采用静置培养；所述的细菌为好氧细菌时，摇床培养。
[0014]上述方法制备获得的细菌基因组DNA悬液可直接用于PCR的细菌DNA模板。每25 μ L PCR体系直接加入1?1.5 μ L细菌基因组DNA悬液作为反应模板。
[0015]本发明与现有技术相比具有如下优点:
[0016]本发明提供一种简便的SDS裂解制备细菌基因组DNA悬液的方法，获得细菌基因组DNA模板悬液，可直接用于PCR的细菌DNA模板；具体为每25 μ LPCR体系加入1?1.5 μ L细菌基因组DNA悬液作为反应模板即可；本发明所述的方法和应用极大的简化了 PCR扩增鉴定(特别是16S rDNA序列的PCR扩增鉴定)，具有广阔的市场应用前景。
【附图说明】
[0017]图1为PCR产物的1 %琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道1:DNAmarker2000，其中750bp条带已知为20ng/ μ L ;泳道2:静止培养12小时后的乳酸菌；泳道3:摇床培养12小时后的醋酸菌。
【具体实施方式】
[0018]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0019]实施例1
[0020](1)乳酸菌培养:用试管装入已灭菌的液体培养基1000mL，接种乳酸菌，采用静置培养，经过夜培养12?16小时；
[0021](2)菌体收集:吸取1000 μ L乳酸菌悬液至一新的离心管，然后12000rpm离心1分钟沉淀菌体，并使用移液器去除上清液；
[0022](3)菌体的裂解:往菌体沉淀加入0.1-10% SDS溶液10 μ L，吹打混匀后，在涡旋振荡器中震荡5分钟裂解乳酸菌；
[0023](4)稀释裂解液:加入490 μ L的无酶无核酸的灭菌双蒸水或者1 XΤΕ溶液，吹打混匀，获得乳酸菌基因组DNA悬液。
[0024]上述方法制备获得的乳酸菌基因组DNA悬液可直接用于PCR的乳酸菌DNA模板。每25 μ L PCR体系加入1.5 μ L上清液作为反应模板即可。
[0025]实施例2
[0026](1)醋酸菌培养:用试管装入已灭菌的液体培养基1000mL，接种醋酸菌，采用静置培养，经过夜培养12?16小时；
[0027](2)菌体收集:吸取1000 μ L醋酸菌悬液至一新的离心管，然后12000rpm离心1分钟沉淀菌体，并使用移液器去除上清液；
[0028](3)菌体的裂解:往菌体沉淀加入0.1-10 % SDS溶液10 μ L，吹打混匀后，在涡旋振荡器中震荡5分钟裂解醋酸菌；
[0029](4)稀释裂解液:加入490 μ L的无酶无核酸的灭菌双蒸水或者1 XΤΕ溶液，吹打混匀，获得醋酸菌基因组DNA悬液。
[0030]上述方法制备获得的醋酸菌基因组DNA悬液可直接用于PCR的醋酸菌DNA模板。每25 μ L PCR体系加入1.5 μ L上清液作为反应模板即可。
[0031]实施例1和实施例2中的PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图如图1所示，该PCR反应采用细菌16S rDNA序列的通用引物27F和1492R，25yL的反应体系，添加了 1.5yL采用实施例1和实施例2制备的DNA模板；取2 μ L产物电泳，凝胶电泳结果显示实施例1和实施例2制备获得的细菌基因组DNA悬液作为PCR模板，可以扩增获得清晰的目的基因条带。
[0032]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种简便的SDS裂解制备细菌基因组DNA悬液的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)细菌培养:用试管装入已灭菌的液体培养基lOOOmL，接种细菌，经过夜培养12?16小时； (2)菌体收集:吸取1000μ L细菌悬液12000rpm离心1分钟沉淀菌体，并去除上清液； (3)菌体的裂解:往菌体沉淀加入10μ L 0.1-10%的SDS溶液，混匀后用涡旋振荡器震荡5分钟； (4)稀释裂解液:加入490μ L的无菌水或者1ΧΤΕ溶液，吹打混匀，稍作离心，即可获得细菌基因组DNA悬液。2.根据权利要求1所述的简便的SDS裂解制备细菌基因组DNA悬液的方法，其特征在于:步骤(1)中所述的细菌为兼性厌氧菌或好氧细菌。3.根据权利要求1所述的简便的SDS裂解制备细菌基因组DNA悬液的方法，其特征在于:步骤(1)中所述的细菌为兼性厌氧菌时，采用静置培养；所述的细菌为好氧细菌时，摇床培养。4.权利要求1?3任一项所述的方法制备获得的细菌基因组DNA悬液直接用于PCR的细菌DNA模板。5.根据权利要求4所述的方法制备获得的细菌基因组DNA悬液直接用于PCR的细菌DNA模板，其特征在于:每25 μ L PCR体系直接加入1?1.5 μ L细菌基因组DNA悬液作为反应模板。
【专利摘要】本发明公开了一种简便的SDS裂解制备细菌基因组DNA悬液的方法及应用，属于生物技术领域。本发明的方法包括以下步骤：(1)细菌培养：用试管装入已灭菌的液体培养基1000mL，接种细菌，经过夜培养12～16小时；(2)菌体收集：吸取1000μL细菌悬液12000rpm离心1分钟沉淀菌体，并去除上清液；(3)菌体的裂解：往菌体沉淀加入10μL？0.1-10％的SDS溶液，混匀后用涡旋振荡器震荡5分钟；(4)稀释裂解液：加入490μL的无菌水或者1×TE溶液，吹打混匀，稍作离心，即可获得细菌基因组DNA悬液。本发明所述的方法和应用极大的简化了PCR扩增鉴定，具有广阔的市场应用前景。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/10, C12Q1/04
【公开号】CN105400774
【申请号】CN201511005071
【发明人】廖振林, 方祥, 李汉荣, 王丽, 钟青萍
【申请人】华南农业大学
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月25日