用于高gc含量的基因组扩增反应试剂及其应用、试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于高GC含量的基因组扩增反应试剂和其应用以及一种试剂盒。本发明用于高GC含量的基因组扩增反应试剂包含的组分有：Tris?HCl 20~50 mmol/L、乙酸钾 3~5 mmol/L、乙酸镁 2~4 mmol/L、二甲基亚砜 5~10V/V %、牛血清白蛋白 30~80 mg/L、NP?40 0.003~0.01V/V %、Tween20 0.003~0.01V/V %、甜菜碱1.0~1.5 mol/L。本发明试剂盒包括根据靶基因设计的引物和本发明用于高GC含量的基因组扩增反应试剂。本发明反应试剂和试剂盒对高GC含量的基因组扩增产物特异性高、条带单一。
【专利说明】用于高GC含量的基因组扩増反应试剂及其应用、试剂盒
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于生物工程技术领域，具体的涉及一种用于高GC含量的基因组扩增反应 试剂、含有所述高GC含量的基因组扩增反应试剂的试剂盒及用于高GC含量的基因组扩增反 应试剂的应用。
[0003]
【背景技术】
[0004] 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是由K.Mullis在 1985年发明 的，是一种体外核酸扩增技术。PCR能够模拟DNA体内复制的过程，以原始的DNA为模板，在聚 合酶和特异性引物、dNTPs及缓冲体系的协同作用下，通过变性、退火、延伸3个步骤，数小时 内将微量的目的基因片段进行富集放大，在合适的条件下能够放大到百万倍。极大的方便 了人类获取微量DNA进行研究，提高了效率。PCR应用已经深入多个研究领域，例如基因克隆 与表达、DNA测序、基因检测、基因改造等。随着PCR技术的进步、应用的推广，也面临着一些 新的问题。例如针对一些高GC含量的靶基因，PCR扩增多数情况下得不到理想的结果，不是 特异性差而导致得到的不是目的基因，就是灵敏度差导致得到的量很少。相对于A、T之间形 成的2对氢键而言，G、C之间能够形成三对氢键，解链所需的能值较高，DNA双链比较难以打 开，并且模板中容易形成稳定的二级结构阻止DNA聚合酶在模板DNA链上的延伸，从而导致 扩增失败。
[0005] 有研究报道一些PCR添加剂能够不同程度的改善高GC含量的基因组PCR扩增，例如 甜菜碱、甘油、DMS0、甲酰胺等，还有一些有机溶剂，例如1、2丙二醇、乙二醇等。自从1993年， Rees.W.A.等首次报道甜菜碱能够降低DNA的Tm值之后，甜菜碱就被广泛应用于各种PCR中， 主要起两个方面的作用：一是能够与双螺旋DNA中的大小沟结合，便于二级结构的打开，保 证扩增反应的进行;二是作为一种中性物质，对DNA聚合酶具有保护作用，且能够减少PCR扩 增过程中的弥撒问题。DMS0作为一种PCR添加剂，很早就用于改善优化PCR条件，其本质是破 坏DNA的氢键结构，促使DNA的二级结构能够很好的打开，提高PCR的特异性。同时研究表明 过高的DMS0浓度能够影响DNA聚合酶的活性，进而抑制PCR反应。有机溶剂也在不同程度上 影响PCR的反应过程，具有一定的改善作用，但鉴于有机溶剂需要单独添加，由于其本身的 粘性，会出现最终的用量不是特别精准，同时绝大多数有机溶剂都对人体有害，使用起来有 所不便。因此，现有用于改善高GC含量的基因组PCR扩增添加剂存在抑制PCR反应，用量难控 制和特异性与灵敏性不理想的问题。
[0006]
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种用于高GC含量的基因组扩 增反应试剂，旨在解决现有用于高GC含量的基因组扩增反应试剂在抑制PCR反应，用量难控 制和特异性与灵敏性不理想的技术问题。
[0008] 本发明的另一目的是提供一种用于高GC含量的基因组扩增的试剂盒和高GC含量 的基因组扩增方法，旨在解决现有高GC含量的基因组PCR扩增效果不理想的技术问题。
[0009] 为了实现上述发明目的，作为本发明的一方面，提供了一种用于高GC含量的基因 组扩增反应试剂。所述用于高GC含量的基因组扩增反应试剂含有如下组分： Tris-HCl 20-50 mmol/L 乙酸钟 3~5 mmol/L 乙酸儀 2~4 mmol/L 二甲基亚砜 5~10V/V % 牛血清白蛋白30~80 mg/L NP-40 0.003-0.01V/V % Tween20 0.003-0.01V/V % 甜菜喊 1·0~1·5 mol/L。
[0010] 作为本发明的另一方面，提供了一种用于高GC含量的基因组扩增的试剂盒。所述 试剂盒包括根据靶基因设计的引物，还包括本发明所述的用于高GC含量的基因组扩增反应 试剂。
[0011] 作为本发明的又一方面，提供了一种高GC含量的基因组扩增方法，包括如下步骤： 将模板DNA在PCR反应试剂中进行PCR反应;其中，所述PCR反应试剂中含有根据靶基因 设计的引物和权利要求1所述的用于高GC含量的基因组扩增反应试剂。
[0012] 本发明与现有技术相比，本发明用于高GC含量的基因组扩增反应试剂通过所含的 组分之间的协效作用，具有以下有益技术效果： (1) 本发明用于高GC含量的基因组扩增反应试剂能够扩增模板GC含量高达82%，甚至更 尚，可用于临床基因检测中尚GC位点的PCR扩增； (2) 适应范围广，针对市场上不同的商业化PCR试剂盒，可以直接协同反应； (3) 可以采用统一的PCR扩增条件能够对不同GC含量、不同长度大小、不同引物对进行 扩增； (4) 用于高GC含量的基因组扩增反应试剂扩增的产物特异性高、条带单一，可以直接用 于后续的测序反应及其他分子实验或者临床检测。
[0013] 本发明用于高GC含量的基因组扩增的试剂盒由于含有本发明用于高GC含量的基 因组扩增反应试剂，因此，其能够扩增模板GC含量高达82%，甚至更高，可用于临床基因检测 中高GC位点的PCR扩增;能够针对不同GC含量、不同长度大小、不同引物对采用统一的PCR扩 增条件进行扩增;本发明试剂盒扩增的产物特异性高、条带单一，可以直接用于后续的测序 反应及其他分子实验或者临床检测。
[0014] 本发明高GC含量的基因组扩增方法采用含有本发明用于高GC含量的基因组扩增 反应试剂的PCR反应试剂进行PCR反应，能够对GC含量高达82%，甚至更高的扩增模板进行扩 增，并使得扩增的产物特异性高、条带单一;而且能够针对不同GC含量、不同长度大小、不同 引物对采用统一的PCR扩增条件进行扩增，使得本发明方法工艺相对简单，提高扩增的效 率。
[0015]
【附图说明】
[0016] 图1为本发明实施案例31中按照程序1进行的PCR扩增产物电泳图；其中Marker的 大小为200(^?、100(^?、80(^?、60(^?、40(^?、20(^? ;胶孔从左到右依次为^?(^、？1^(：、 rsl99726272、PLCB3、Marker、notch3-33FlRl、rs45470261、rs572346021、notch3-33FR、 notch3-10FlRl； 图2为本发明实施案例31中按照程序2进行的PCR扩增产物电泳图；其中Marker的大小 为200(^口、100(^口、80(^口、60(^口、40(^口、20(^口；胶孔从左到右依次为：4?(^、？1^(：、 rsl99726272、PLCB3、Marker、notch3-33F2R2、rs572346021、notch3-33FlRl、rs45470261、 notch3-10FlRl； 图3为本发明实施案例31-33中相应的序列测序结果； 图4为本发明实施案例31-33中相应的序列测序结果。
[0017]
【具体实施方式】
[0018] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。
[0019] 本发明实施例说明书中所提到的体积份数不仅仅可以指代各组分的体积比例关 系，也可以表示各组具体体积含量，因此，只要是按照本发明实施例说明书组合物各组分的 体积份数按比例放大或缩小均在本发明实施例说明书公开的范围之内。具体地，本发明实 施例说明书中所述的体积份数可以是μ 1、L等生化领域公知的体积单位。
[0020]与本发明相关关键词的解释： Tris-HCl: Tr is (hydroxymethyl )ami nomethane，三（轻甲基）氨基甲烧，分子式为 C4HiiN03 DMSO:Dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜，一种含硫有机化合物，分子式为(CH3)2S0 Betaine:甜菜碱 NP-40:裂解液（NP-40 Lysis Buffer) Tween20:吐温 20 BSA:牛血清白蛋白 dNTP:deoxy_ribonucleoside triphosphate,脱氧核糖核苷三磷酸。
[0021] -方面，本发明实施例提供了一种用于高GC含量的基因组扩增反应试剂。所述用 于高GC含量的基因组扩增反应试剂包含如下组分： Tris-HCl 20-50 mmol/L 乙酸钾(K0AC) 3~5 mmol/L 乙酸儀(Mg(0AC)2) 2~4 mmol/L 二甲基亚砜(DMSO) 5-10V/V % 牛血清白蛋白（BSA) 30~80 mg/L NP-40 0.003-0.01V/V % Tween20 0.003-0.01V/V % 甜菜喊（Betaine) 1.0~1.5 mol/L〇
[0022]这样，本发明实施例用于高GC含量的基因组扩增反应试剂通过所含的组分之间的 协效作用，使得其能够扩增模板GC含量高达82%，甚至更高;能够针对不同GC含量、不同长度 大小、不同引物对采用统一的PCR扩增条件扩增，且使得扩增产物特异性高、条带单一，可以 直接用于后续的测序反应及其他分子实验或者临床检测。具体地，一定浓度的DMS0可以破 坏DNA的氢键，促使DNA双链进行解链，配合使用一定浓度的甜菜碱能够有效保护DNA聚合酶 的活性，最大程度的减少由于DMS0带来的DNA聚合酶活性的降低。从而达到成功扩增的效 果。
[0023] 在一具体实施例中，该Tris-HCl可以选用pH为9.0的Tris-HCl。在一些具体实施例 中，在含量可以是 20mmol/L、22mmol/L、25mmol/L、26mmol/L、28mmol/L、33mmol/L、36mmol/ T,.38mmo1 /T,.40mmo1 /T,.42mmo1 /T,.44mmo1 /T,.46mmo1 /T,.48mmo1 /1,.50 mmol/L等浓度。
[0024] 在一些具体实施例中，乙酸钾的含量可以是3mmol/L、4mmol/L、5 mmol/L等浓 度。
[0025] 在一些具体实施例中，乙酸镁的含量可以是2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L等浓度。
[0026] 在一些具体实施例中，二甲基亚砜的含量可以是5V/V%、6V/V %、7V/V %、8V/V %、 9V/V %、10V/V %等体积百分比含量。
[0027] 在一些具体实施例中，牛血清白蛋白的含量可以是30mg/L、35mg/L、40mg/L、45mg/ L、50mg/L、55mg/L、60mg/L、65mg/L、70mg/L、75mg/L、80mg/L 等浓度。
[0028] 在一些具体实施例中，NP-40和Tween20的含量可以相同的不相同是0.003V/V%、 0.004V/V %、0.005V/V %、0.006V/V %、0.007V/V %、0.008V/V %、0.009V/V %、0.01V/V %等 体积百分比含量。
[0029] 在一些具体实施例中，甜菜碱的含量可以是1 mol/L、l.lmol/L、1.2mol/L、 1 · 3mol/L、1 · 4mol/L、1 · 5mol/L 等浓度。
[0030] 通过对上述各成分的浓度进行调节，能够优化组分之间的协效作用，从而提高本 发明实施例用于高GC含量的基因组扩增反应试剂对高GC含量的基因组进行扩增，并扩增产 物特异性高、条带单一。
[0031] 另一方面，在上文用于高GC含量的基因组扩增反应试剂的基础上，本发明实施例 还提供了一种用于高GC含量的基因组扩增的试剂盒。所述试剂盒除了可以包含现有PCR所 有的试剂，还必须包含有上文所述的本发明实施例用于高GC含量的基因组扩增反应试剂。 在一实施例中，该用于高GC含量的基因组扩增反应试剂可以与试剂盒中的其他试剂分开保 存放置，待扩增时在按照比例要求进行混合处理;也可以与试剂盒中的其他试剂按照一定 的比例进行混合，形成混合试剂，在扩增时直接使用。在另一实施例中，本发明实施例用于 高GC含量的基因组扩增的试剂盒中所含量的上文本发明实施例用于高GC含量的基因组扩 增反应试剂的量可以根据扩增的次数以及每次扩增所需要的用量灵活控制 在进一步实施例中，本发明实施例试剂盒所含的还包括PCR buffer、dNTPs、DNA聚合酶 和灭菌超纯水试剂中的至少一种等PCR试剂。该些PCR试剂也可以分开保存放置，待扩增时 在按照比例要求进行混合处理;也可以按照一定的比例进行混合，形成混合试剂，在扩增时 直接使用。在具体实施例中，所述DNA聚合酶为Taq酶。
[0032] 由于本发明实施例用于高GC含量的基因组扩增的试剂盒含有上文本发明实施例 用于高GC含量的基因组扩增反应试剂，因此，其能够扩增模板GC含量高达82%，甚至更高，可 用于临床基因检测中高GC位点的PCR扩增;能够针对不同GC含量、不同长度大小、不同引物 对采用统一的PCR扩增条件进行扩增;本发明试剂盒扩增的产物特异性高、条带单一，可以 直接用于后续的测序反应及其他分子实验或者临床检测。
[0033] 又一方面，在上文用于高GC含量的基因组扩增反应试剂的基础上，本发明实施例 还提供了一种高GC含量的基因组扩增方法。该扩增方法包括如下步骤： 将模板DNA在PCR反应试剂中进行PCR反应;其中，所述PCR反应试剂中含有根据靶基因 设计的引物和权利要求1所述的用于高GC含量的基因组扩增反应试剂。
[0034]其中，模板DNA可以根据待扩增的目的DNA进行临时提取，如采用美国OMEGA公司的 试剂盒D3392-01从含有目标DNA原材中进行提取。另外，该模板DNA可以是任何希望扩增的 目的DNA，尤其是高GC含量的DNA。在具体实施例中，该模板DNA可以是含有rs545470261; rs572346201两个SNP位点的人F0XC1基因、含有外显子33、外显子10的人notch3基因片段、 含有rs7412、rs429358 SNP位点的ΑΡ0Ε基因、PLEC基因中的部分序列、PLCB3基因组的部分 序列、含有rs 199726272 SNP位点的0BSCN基因等。
[0035] 由于是进行PCR反应，因此，本发明实施例方法中所用的PCR反应试剂应当理解成 必须包含有能够实现PCR反应的常规试剂，如根据靶基因设计的引物、PCR buffer、dNTPs、 DNA聚合酶和灭菌超纯水试剂中的至少一种。除了PCR反应试剂必须包含有能够实现PCR反 应的常规试剂之外，在本发明实施例中，该PCR反应试剂还必须包含有上文所述的本发明实 施例用于高GC含量的基因组扩增反应试剂。由于该用于高GC含量的基因组扩增反应试剂的 存在，该用于高GC含量的基因组扩增反应试剂与PCR反应的其他试剂作用，从而使得本发 明实施例方法能够对GC含量高达82%，甚至更高的扩增模板进行扩增，并使得扩增的产物特 异性高、条带单一;而且能够针对不同GC含量、不同长度大小、不同引物对采用统一的PCR扩 增条件进行扩增，使得本发明方法工艺相对简单，提高扩增的效率。
[0036] 在一实施例中，本发明实施例方法中的PCR反应试剂与所述模板DNA构成PCR扩增 体系，以所述PCR扩增体系总体积为20体积份数计，所述PCR扩增体系如下： 10XPCR buffer 2.0体积份数 10mM dNTPs 0.2体积份数 5 μ mol/L上引物 1.0体积份数 5 μ mol/L下引物 1.0体积份数 模板DNA 1.0体积份数 DNA聚合酶 0.2体积份数 本发明实施例用于高GC含量的基因组扩增反应试剂10体积份数 灭菌超纯水 补足至20体积份数。
[0037]在进一步具体实施例中，PCR扩增体系所含的所述DNA聚合酶为Taq酶。
[0038]通过控制PCR扩增体系各组分的浓度，从而能够优化组分之间的协效作用，从而提 高本发明实施例用于高GC含量的基因组扩增反应试剂对高GC含量的基因组进行扩增，并扩 增产物特异性高、条带单一，且能够针对不同GC含量、不同长度大小、不同引物对采用统一 的PCR扩增条件进行扩增，使得本发明方法工艺相对简单，提高扩增的效率。
[0039] 在一实施例中，所述PCR反应的反应程序为下述反应程序一： 95°C热启动5min，l个循环； 94°C变性30s s，63~65°C退火30~45s s，72°C延伸60s，10个循环； 94°C变性30s s，58~60°C退火30~45s s，72°C延伸60s，10个循环； 94°C变性30s，55°C退火30~45s s，72°C延伸60s，10个循环； 94°C变性30s，52°C退火30~45s s，72°C延伸60，10个循环； 72°C延伸7min，16°C结束PCR反应； 在一具体实施例中，上述PCR反应的反应程序一如下： 95°C热启动5min，l个循环； 94°C变性30s，65 °C退火30s，72 °C延伸60s，10个循环； 94 °C变性30s，60 °C退火30s，72 °C延伸60s，10个循环； 94°(：变性3〇8,55°(：退火3〇8,72°(：延伸6〇8，10个循环； 94 °C变性30s，52 °C退火30s，72 °C延伸60s，9个循环； 72°C延伸7 min，16°C结束PCR反应； 在另一实施例中，上述PCR反应的反应程序为下述反应程序二进行扩增： 95°C热启动5min，l个循环； 94 °C变性30s，69~70 °C退火30~45s，72 °C延伸60s，5个循环； 94 °C变性30s，66~68 °C退火30~45s，72 °C延伸60s，5个循环； 94°C 变性 3〇8,63~65°(：退火30~458,72°(：延伸6〇8，10个循环； 94°C 变性 308,58~60°(：退火30~458,72°(：延伸608，10个循环； 94 °C变性30s，50~55 °C退火30~45s，72 °C延伸60s，9个循环； 72°C延伸7 min，16°C结束PCR反应。
[0040] 在一具体实施例中，上述PCR反应的反应程序二如下： 95°C热启动5min，l个循环； 94°C变性30s，°C退火30s，72°C延伸60s，5个循环； 94 °C变性30s，68 °C退火30s，72 °C延伸60s，5个循环； 94°(：变性3〇8,65°(：退火3〇8,72°(：延伸6〇8，10个循环； 94 °C变性30s，60 °C退火30s，72 °C延伸60s，10个循环； 94 °C变性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸60s，9个循环； 72°C延伸7 min，16°C结束PCR反应。
[0041 ]在本发明实施例方法的PCR扩增体系含有用于高GC含量的基因组扩增反应试剂的 基础上，通过对扩增程序的优化控制，提高用于高GC含量的基因组扩增反应试剂所发挥的 作用，提高对GC含量高达82%，甚至更高的扩增模板进行扩增的效果，提高扩增的产物特异 性高、条带单一。
[0042] 以下结合具体实施例对上述用于高GC含量的基因组扩增反应试剂、含有用于高GC 含量的基因组扩增反应试剂的试剂盒及高GC含量的基因组扩增方法进行详细说明。
[0043] 用于高GC含量的基因组扩增反应试剂实施例： 实施例11 本实施例提供了一种用于高GC含量的基因组扩增反应试剂。所述用于高GC含量的基因 组扩增反应试剂包含如下组分： Tris-HCl 20-50 mmol/L PH 9.0 乙酸钟 3~5 mmol/L 乙酸儀 2~4 mmol/L 二甲基亚砜 5-10% V/V % 牛血清白蛋白30~80 mg/L NP-40 0.003-0.01% V/V % Tween20 0.003-0.01%V/V % 甜菜喊 1.0-1.5 mol/L。
[0044] 用于高GC含量的基因组扩增的试剂盒实施例： 实施例21 在现有的PCR试剂盒中分别增加上述实施例11的用于高GC含量的基因组扩增反应试 剂，形成用于高GC含量的基因组扩增的试剂盒。
[0045] 高GC含量的基因组扩增方法盒实施例： 实施例31 本实施例31提供一种扩增人F0XC1基因中的rs545470261;rs572346201两个SNP位点的 方法。
[0046] 1.DNA模板制备 用美国OMEGA公司的试剂盒D3392-01提取人的200μ1血液DNA，得到浓度为55.1ngAil 的DNA，共计 65μ1 WD260/280 比值为 1.94，0D260/230 的比值为2.1。
[0047] 2.引物设计 用rs545470261;rs572346201两个SNP上下游各200bp序列为模板，以01igo7.0软件设 计引物，产物扩增大小及其GC含量具体如下表1: 表1
3.PCR反应 PCR扩增体系见下表2: 表2
4. PCR扩增程序 使用ABI9700 PCR仪进行PCR反应，反应程序分别按照下述程序1和程序2的程序进行扩 增： (1) 程序1: 95°C热启动5min，l个循环； 94°C变性30s，65°C退火30s，72°C延伸60s，，10个循环； 94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，，10个循环； 94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，，10个循环； 94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸60s，，9个循环； 72°C延伸7 min，16°C结束PCR反应； (2) 程序2: 95°C热启动5min，l个循环； 94°C变性30s，70°C退火 30s，72°c延伸60s，，5个循环； 94°C变性30s，68°C退火30s，72°C延伸60s，，5个循环； 94°C变性30s，65°C退火30s，72°C延伸60s，，10个循环； 94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，，10个循环； 94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，，9个循环； 72°C延伸7 min，16°C结束PCR反应； 5. 结果检测 反应结束后，取5yL反应产物，2%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图1、2所示。其中， 图1是按照程序1的扩增电泳图。具体在图1中的Marker的大小为2000bp、1000bp、800bp、 60(^?、40(^?、20(^?;胶孔从左到右依次为^?(^、？1^(：、18199726272、？^83、]\^46『、 notch3_33FlRl、rs45470261、rs572346021、notch3-33FR、notch3_10FlRl。
[0048] 图2是按照程序2的扩增电泳图。具体在图1中的Marker的大小为2000bp、1000bp、 800bp、600bp、400bp、200bp。
[0049] 胶孔从左到右依次为：AP0E、PLEC、rsl99726272、PLCB3、Marker、notch3-33F2R2、 rs572346021、notch3-33FlRl、rs45470261、notch3-10FlRl。
[0050] 6.测序结果 剩余反应产物直接送奥美德诺(北京)基因科技有限公司测序部测序，测序结果位点附 件序列如图3、图4所示。
[0051 ] 实施案例32: 本实施例提供一种扩增人notch3基因中的外显子33、外显子10部分片段。
[0052] 1.DNA模板制备 用美国OMEGA公司的试剂盒D3392-01提取人的200μ1血液DNA，得到浓度为55.1ngAil 的DNA，共计 65μ1 WD260/280 比值为 1.94，0D260/230 的比值为2.1。
[0053] 2.引物设计 用notch3基因的全序列为模板，以01 ig〇7.0软件设计引物，产物扩增大小及其GC含量 具体如下表3: 表3
3.PCR反应 PCR扩增体系见下表4: 表4
4. PCR扩增程序 使用ABI9700 PCR仪进行PCR反应，反应程序分别按照下述程序1和程序2的程序进行扩 增： (1) 程序1: 95°C热启动5min，l个循环； 94°C变性30s，65°C退火30s，72°C延伸60s，，10个循环； 94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，，10个循环； 94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，，10个循环； 94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸60s，，9个循环； 72°C延伸7 min，16°C结束PCR反应； (2) 程序2: 95°C热启动5min，l个循环； 94°C变性30s，70°C退火 30s，72°c延伸60s，，5个循环； 94°C变性30s，68°C退火30s，72°C延伸60s，，5个循环； 94°C变性30s，65°C退火30s，72°C延伸60s，，10个循环； 94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，，10个循环； 94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，，9个循环； 72°C延伸7 min，16°C结束PCR反应； 5. 结果检测 反应结束后，取5yL反应产物，2%琼脂糖凝胶电泳检测，见图1、2。
[0054] 实施案例33 本实施例提供一种检测人ΑΡ0Ε基因中的rs7412、rs429358 SNP位点；PLEC基因中的部 分序列、PLCB3基因组的部分序列、0BSCN基因中的rsl99726272 SNP位点。
[0055] 1.DNA模板制备 用美国OMEGA公司的试剂盒D3392-01提取人的200μ1血液DNA，得到浓度为55.1ngAil 的DNA，共计 65μ1 WD260/280 比值为 1.94，0D260/230 的比值为2.1。
[0056] 2.引物设计 根据本实施例1提供的DNA模板的基因全序列模板，以01 ig〇7.0软件设计引物，产物扩 增大小及其GC含量具体如下表5: 表5
3. PCR反应 PCR扩增体系见下表6: 表6
4. PCR扩增程序 使用ABI9700 PCR仪进行PCR反应，反应程序分别按照下述程序1和程序2的程序进行扩 增： (1) 程序1: 95°C热启动5min，l个循环； 94°C变性30s，65°C退火30s，72°C延伸60s，，10个循环； 94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，，10个循环； 94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，，10个循环； 94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸60s，，9个循环； 72°C延伸7 min，16°C结束PCR反应； (2) 程序2: 95°C热启动5min，l个循环； 94°C变性30s，70°C退火 30s，72°c延伸60s，，5个循环； 94°C变性30s，68°C退火30s，72°C延伸60s，，5个循环； 94°C变性30s，65°C退火30s，72°C延伸60s，，10个循环； 94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，，10个循环； 94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸60s，，9个循环； 72°C延伸7 min，16°C结束PCR反应； 5、结果检测 反应结束后，取5yL反应产物，2%琼脂糖凝胶电泳检测，见图1、2。需要说明的是，经测 试结果显示，选取实施例11小幅范围中的点值分别做下述实验，最终的凝胶电泳图基本一 致，也即是实施例11中小幅范围的含量对最终的扩增影响不大，都能获得高特异性产物，且 凝胶电泳条带单一。
[0057]由上述实施例31-33的测试结果可知，本发明实施例高GC含量的基因组扩增方法 由于采用了含有本发明实施例提供的用于高GC含量的基因组扩增反应试剂，因此，能够对 GC含量高达82%甚至更高的扩增模板进行扩增，并使得扩增的产物特异性高、条带单一;而 且能够针对不同GC含量、不同长度大小、不同引物对采用统一的PCR扩增条件进行扩增，使 得本发明实施例方法工艺相对简单，提高扩增的效率。
[0058] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于高GC含量的基因组扩增反应试剂，其特征在于，包含如下组分： Tris-HCl 20-50 mmol/L 乙酸钟 3~5 mmol/L 乙酸儀 2~4 mmol/L 二甲基亚砜 5~10V/V % 牛血清白蛋白30~80 mg/L NP-40 0.003-0.01V/V % Tween20 0.003-0.01V/V % 甜菜喊 1 ·0~1.5 mol/L。2. -种用于高GC含量的基因组扩增的试剂盒，其特征在于，包括根据靶基因设计的引 物，还包括权利要求1所述的用于高GC含量的基因组扩增反应试剂。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:还包括PCR buffer、dNTPs、DNA聚合酶和 灭菌超纯水试剂中的至少一种。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于:所述DNA聚合酶为Taq酶。5. -种高GC含量的基因组扩增方法，包括如下步骤： 将模板DNA在PCR反应试剂中进行PCR反应;其中，所述PCR反应试剂中含有根据靶基因 设计的引物和权利要求1所述的用于高GC含量的基因组扩增反应试剂。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于:所述PCR反应的反应程序为下述反应程 序一或反应程序二： 反应程序一： 95°C热启动5min，l个循环； 94°(：变性3〇8,63~65°(：退火30~458,72°(：延伸6〇8，10个循环； 94°(：变性308,58~60°(：退火30~458,72°(：延伸608，10个循环； 94°C变性30s，55°C退火30~45s，72°C延伸60s，10个循环； 94°C变性30s，52°C退火30~45s，72°C延伸60s，9个循环； 72°C延伸7 min，16°C结束PCR反应； 反应程序二： 95°C热启动5min，l个循环； 94°C 变性 30s，69~70°C 退火 30~45s，72°c 延伸 60s，5 个循环； 94 °C变性30 s，66~68 °C退火30~45 s，72 °C延伸60s，5个循环； 94°C 变性 3〇8,63~65°(：退火30~458,72°(：延伸6〇8，10个循环； 94°C变性30s，58~60°C退火30~45s，72°C延伸60s，10个循环； 94°C变性30s，50~55° C退火30~45s，72°c延伸60s，9个循环； 72°C延伸7 min，16°C结束PCR反应。7. 根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR反应试剂还包括10 XPCR 1311打6广(1阶?8、0嫩聚合酶和灭菌超纯水，所述?0?反应试剂与所述模板0嫩构成?0財广增体 系，以所述PCR扩增体系总体积为20体积份数计，所述PCR扩增体系如下： 10XPCR buffer 2.0体积份数 10mM dNTPs 0.2体积份数 5. mol/L上引物 1.0体积份数 5. mol/L下引物 1.0体积份数 模板DNA 1.0体积份数 DNA聚合酶 0.2体积份数 所述用于高GC含量的基因组扩增反应试剂10体积份数 灭菌超纯水 补足至20体积份数。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述DNA聚合酶为Taq酶。
【文档编号】C12N15/10GK105969762SQ201610249847
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年4月21日
【发明人】吕荣军
【申请人】奥美德诺（北京）基因科技有限公司