一种海洋细菌基因LfliZ及应用

一种海洋细菌基因LfliZ及应用
【专利摘要】本发明涉及一种海洋细菌基因LfliZ及其应用。一种海洋细菌基因LfliZ，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明还涉及该基因LfliZ表达的重组蛋白LfliZ及在制备2′,3′?环形核苷单磷酸中的应用。本发明克隆的基因LfliZ编码的蛋白LfliZ能够在大肠杆菌胞内结合四种2′,3′?环形核苷单磷酸。通过提纯重组LfliZ蛋白，可以实现从大肠杆菌中同时直接提取四种2',3'?环形核苷单磷酸。经计算每升培养液可提取约2.5mg的四种纯品2',3'?环形核苷单磷酸，有较好的应用潜力。
【专利说明】
一种海洋细菌基因 Lf I iZ及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种海洋细菌基因 LfliZ及其应用，属于生物技术技术领域。
【背景技术】
[0002] 海洋微生物数量巨大，新种资源极其丰富，也存在大量新基因资源。随着技术的进 步，海洋微生物资源的开发成为各国研究的焦点。但是，由于采样和培养等困难，目前对海 洋微生物资源及其基因资源的开发利用还很有限。发现海洋中新基因并研究其功能，对开 发和利用海洋微生物基因资源具有重要意义。
[0003] 环形核苷酸是细胞内重要的第二信使，参与细胞内多种信号转导途径的调控。现 已知发现的第二信使包括环形腺苷单磷酸(3'5^-cAMP)、环形鸟苷单磷酸(3'5~cGMP)、 环形胞苷单磷酸(3'，5' -cCMP)、环形尿苷单磷酸(3'，5' -cUMP)、环形二鸟苷酸(c-di-GMP)， 环形二腺苷酸(c-di-AMP)及环形鸟苷腺苷酸（cGAMP)。除了上述已发现的环形核苷酸类第 二信使外，在2009年埃德温(Edwin)等人还首次在人的肾脏细胞中发现了腺苷-2'，3'_环形 单磷酸(2' J'-cAMP)，随后人们又在哺乳动物的大脑等组织细胞中发现了腺苷-2'，3'_环 形单磷酸的存在。科研人员还从植物细胞中检测到腺苷-2'，3'_环形单磷酸和鸟苷-2'，3'_ 环形单磷酸(2' J^cGMP)，从一株荧光假单胞菌中检测到胞苷_2'，3'_环形单磷酸(2' ,3^ cCMP)和尿苷_2'，3'_环形单磷酸（2' J^cUMP)的存在。现有的研究结果表明，这四种2'， 环形核苷单磷酸很可能代表了另外一类新型的生物细胞第二信使。
[0004] 由于2' 环形核苷单磷酸吸引了越来越多的关注，其在科学研究和医学上的需 求也日益增多。目前2'，3'-环形核苷单磷酸的制备均采用化学合成的方法，尚未有生物制 备方法。化学合成法生产2'，3'_环形核苷单磷酸，产量低，价格高，在一定程度上限制了其 开发应用。

【发明内容】

[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一种海洋细菌基因 LfliZ及利用其重组LfliZ蛋 白快速制备四种2'，3~环形核苷单磷酸(腺苷-2'，3'_环形单磷酸、鸟苷-2'，3'_环形单磷 酸、胞苷-2'，3'_环形单磷酸和尿苷-2'，3'_环形单磷酸)的方法。
[0006] 本发明技术方案如下：
[0007] 一种海洋细菌基因 LfliZ，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 上述海洋细菌基因 LfliZ表达的重组蛋白LfliZ，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0009] -种重组载体，在质粒中插入含有上述海洋细菌基因 LfliZ。
[0010] 根据本发明优选的，所述的质粒为pET-22b( + )质粒。
[0011] -种重组细胞，将上述重组载体转化入宿主细胞中获得。
[0012] 根据本发明优选的，所述的宿主细胞为大肠杆菌;进一步优选的，所述的宿主细胞 为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0013] 上述海洋细菌基因 LfliZ在制备2' 环形核苷单磷酸中的应用。
[0014] 上述应用，步骤如下：
[0015] ⑴制备核酸序列如SEQ ID No.l所示的海洋细菌基因 LfliZ;
[0016] (2)构建含有SEQ ID No.l所示核苷酸序列的重组载体；
[0017] (3)构建含有步骤(2)所示重组载体的重组细胞；
[0018] (4)发酵培养上述重组细胞，经提取纯化，制得2'，3'_环形核苷单磷酸。
[0019] 根据本发明优选的，所述步骤(2)的重组载体采用的质粒为pET_22b( + )质粒;所述 步骤(3)中的重组细胞采用的宿主细胞为大肠杆菌;进一步优选的，所述的宿主细胞为大肠 杆菌 BL21(DE3)。
[0020]根据本发明优选的，所述步骤(4)中，发酵培养步骤如下：
[0021] 先在35~38°C、150~200rpm条件下扩大培养至菌液在波长为600nm时的吸光度为 0.8;然后在18~22°C、100~140rpm继续培养25~35min;然后加入IPTG(异丙基硫代半乳糖 苷)至浓度为O.lmM，继续诱导培养22~25小时；
[0022]所述发酵培养采用的培养基为LB液体培养基，每升组分如下：
[0023] 10g NaCl，10g蛋白胨，5g酵母粉，蒸馏水定容至lL，pH 8.0。
[0024] 根据本发明优选的，所述步骤(4)中的提取纯化，步骤如下：
[0025] ( i)将发酵液经固液分离，取菌体，破碎菌体，固液分离，取上清液，经镍柱亲和层 析，洗脱后，制得目的蛋白Lf 1 iZ溶液；
[0026] (ii)将步骤⑴制得的目的蛋白Lf 1 iZ溶液在-1~2°C静置2.5~3.5天，离心，取上 清液，经超滤，制得2 '，3 环形核苷单磷酸粗提液；
[0027] (iii)将步骤(ii)制得的2'，3'_环形核苷单磷酸粗提液经C18反向色谱柱进行高效 液相色谱纯化，分别制得四种2 '，3 环形核苷单磷酸。
[0028] 根据本发明进一步优选的，所述步骤(i)中采用镍柱亲和层析，步骤如下：
[0029] 将破碎细胞后的上清液上样镍柱，每根镍柱装2mL镍胶，待上清液流过镍胶后，每 根镍柱用20mL裂解缓冲液平衡，用20mL冲洗缓冲液冲洗，最后用10mL的洗脱缓冲液洗脱，制 得重组蛋白LfliZ溶液；
[0030] 所述裂解缓冲液组分为：50mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH8.0;
[0031] 所述冲洗缓冲液组分为:50mM Tris-HCl、150mM NaCl、50mM咪唑，pH8.0;
[0032] 所述洗脱缓冲液组分为：50mM Tris-HCl、150mM NaCl、250mM咪唑，pH8.0。
[0033] 根据本发明进一步优选的，所述步骤（ii)中，超滤为采用截留分子量为3K的超滤 管超滤。
[0034] 根据本发明进一步优选的，所述步骤（iii)中C18反向色谱柱进行高效液相分离的 分离程序为：〇min，B液0 % ; 2 · 5min，B液0 % ; 5min，B液30 % ; 10min，B液60 % ; 14min，B液 100% ;21min，B液 100% ;22min，B液50% ;23min，B液0% ;30min，B液0%;流速为 10ml/min， 检测波长为254nm;
[0035] 流动相为:A液，10mM醋酸铵溶液，pH 5.0;B液，将A液与甲醇按体积比3:1的比例混 合。
[0036] 有益效果
[0037]本发明克隆的基因 LfliZ编码的蛋白LfliZ能够在大肠杆菌胞内结合四种2' ,3^ 环形核苷单磷酸，即腺苷-2'，3'_环形单磷酸、鸟苷-2'，3'_环形单磷酸、胞苷-2'，3'_环形 单磷酸和尿苷-2'，3'_环形单磷酸。通过提纯重组LfliZ蛋白，可以实现从大肠杆菌中同时 直接提取四种2'，3环形核苷单磷酸。经计算每升培养液可提取约2.5mg的四种纯品2 '， 3 环形核苷单磷酸，有较好的应用潜力。
【附图说明】
[0038] 图1、通过PCR克隆的LfliZ基因的琼脂糖凝胶电泳图；
[0039] 图中：M、核酸分子量标记(marker) ;LfliZ、LfliZ基因；
[0040] 图2、镍柱亲和层析纯化的重组蛋白LfliZ的SDS-PAGE电泳图；
[0041]图中:M、蛋白质分子量标记(marker) ;LfliZ、镍柱亲和层析纯化后的重组LfliZ蛋 白；
[0042]图3、提取含4种2'，3'-环形核苷单磷酸粗提液的HPLC分析；
[0043] 图4、纯化得到的2'，3' -cCMP液相色谱和质谱分析；
[0044] (a)，液相色谱分析纯化得到的2' ,37 -cCMP;
[0045] (b)，一级质谱分析纯化得到的Y，3~cCMP，图谱显示提纯的Y，3~cCMP的质荷比 为306.0491 (z = 1 )，与理论值306.0486极为相符；
[0046] (c)』'J'-cCMP结构示意图；
[0047]图5、液相色谱，质谱分析纯化得到的2' J^cUMP;
[0048] (a)，液相色谱分析纯化得到的2\3~cUMP;
[0049] (b)，一级质谱分析纯化得到的Y，3~cUMP，图谱显示提纯的Y，3~cCMP的质荷比 为307.0331 (z = 1 )，与理论值307.0326极为相符；
[0050] (c)』'J'-cUMP结构示意图；
[0051 ]图6、液相色谱，质谱分析纯化得到的2' ,3' -cGMP;
[0052] (a)，液相色谱分析纯化得到的2\3~cGMP;
[0053] (b)，一级质谱分析纯化得到的Y，3~cGMP，图谱显示提纯的Y，3~cCMP的质荷比 为346.0552 (z = 1 )，与理论值346.0547极为相符；
[0054] (c)』'J'-cGMP结构示意图；
[0055] 图7、液相色谱，质谱分析纯化得到的2'，3' -cAMP;
[0056] (a)，液相色谱分析纯化得到的2'彳-cAMP;
[0057] (b)，一级质谱分析纯化得到的2' J'-cAMP，图谱显示提纯的2' J'-cCMP的质荷比 为330.06 (z = 1 )，与理论值330.0598极为相符；
[0058] (c)』'J'-cAMP结构示意图。
【具体实施方式】
[0059] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明所保护范围不限于 此。
[0060] 生物材料来源：
[0061 ] E.coli DH5a、E.coli BL21(DE3)菌株购自TransGen Biotech公司；
[0062] pET_22b( + )表达载体购自Novagen公司；
[0063] PCR扩增试剂均购自TransGen Biotech公司；
[0064] 限制性内切酶及连接酶Solution I购自Takara公司；
[0065] 细菌基因组提取试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；
[0066] DNA胶回收试剂盒购自Omega公司；
[0067] 2' J-cCMP和2' J-cAMP购买自Sigma-Aldrich公司；
[0068] 2' J-cUMPj J-cGMPj Y-cCMPj Y-cUMPd' Y-cGMP和3' Y-cAMP购 买自Biolog公司；
[0069] 所用抗生素氨苄青霉及诱导剂IPTG购自Merck公司；
[0070]甲醇购自天津市科密欧化学试剂有限公司；
[0071]培养基配制原料均为本领域常用原料，可市场购得；
[0072] DNA测序在北京博尚生物技术有限公司完成；
[0073]引物合成在华大基因完成；
[0074] 深海适冷菌假交替单胞菌株(Pseudoalteromonas sp. )SM9913,购自中国典型培 养物保藏中心，保藏号CCTCC N0:M2010223。
[0075] 实施例1
[0076] LfliZ基因的克隆及表达载体的构建，步骤如下：
[0077] ILfliZ基因的克隆
[0078] 1 · IPs · sp · SM9913基因组DNA的提取
[0079] 参照百泰克公司基因组提取试剂盒说明书提取基因组DNA(常规提取步骤）。
[0080] 1.2引物设计与合成
[0081] 根据LfliZ基因序列设计两条引物：
[0082] F:GGAATTCCATATGAGTAACCAATCAG
[0083] R：CCGCTCGAGTGCATTGGTTTTTTTTGC [0084]由上海生工生物技术公司合成。
[0085] 1.3利用PCR进行基因序列扩增及产物回收
[0086] (1)以F和R为引物，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增;PCR反应条件为:95°C预变 性 5min;95°C 变性 30sec，55°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，30 个循环；72°C 终延伸 5min。
[0087] PCR扩增体系（50yL)如下：
[0088] 灭菌蒸馏水32.2yL
[0089] 5 X TransStart FastPfu缓冲液 10yL
[0090] dNTP 混合物 5yL
[0091] 引物F(50yM) 0.4yL
[0092] 引物R(5〇yM) 0.4yL
[0093] 基因组 DNA lyL
[0094] TransStartFastPfuDNA聚合酶 lyL
[0095] (2)对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果获得一条约400bp的DNA片段(如 图1所示），然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增出的DNA片段，制得基因 LfliZ。
[0096] 2.表达载体及表达菌株的构建
[0097] (l)DNA片段与表达载体酶切
[0098] 将制得的基因 LfliZ和载体pET-22b( + )用Ndel和Xhol双酶切，酶切反应体系如下：
[0099] 缓冲液2yL
[0100] 基因 LlifZ或载体pET-22b(+) 8yL
[0101] Ndel内切酶 lyL
[0102] Xhol 内切酶 lyL
[0103] 灭菌蒸馏水8yL
[0104] 盖紧盖子，手指轻弹离心管，混匀样品，在离心机上瞬时离心2sec，把样品集中在 管底，37°C温浴30min。
[0105] (2)对酶切产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切胶，然后用Omega公司的 DNA回收试剂盒按照其说明回收目的DNA片段。
[0106] (3)DNA片段与表达载体连接
[0107] 连接反应体系如下：
[0108] 酶切后的载体 pET-22b(+) lyL
[0109] 酶切后的基因 LfliZ 4yL
[0110] Solution I 5yL
[0111] 盖紧盖子，手指轻弹离心管，混匀样品，在离心机上瞬时离心2sec，把样品集中在 管底，16 °C连接过夜。
[0112] (4)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pET-22b-LfliZ载 体转至大肠杆菌BL21(DE3)感受态。具体的步骤为:将连接液加入50yL大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞中，混匀后冰浴30min; 42°C水浴90s;快速转至冰浴，冷却l-2min;加入600yL液 体LB培养基，37°C水浴lh;离心后用约100yL重悬菌体涂布至含有氨苄青霉素的麦康凯平板 上，37 °C过夜培养。
[0113] 转化子送上海生工生物技术有限公司测序验证，获得转入重组pET-22b-LfliZ载 体的表达菌株。
[0114] 经检测，基因 LfliZ核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0115] 实施例2
[0116] 1.重组菌株的发酵培养
[0117] (1)种子的培养
[0118] 挑取平板上的转入重组pET-22b-LfliZ载体的表达菌株到100mL加入了终浓度为 l〇〇yg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C，180rpm过夜培养；
[0119] (2)按照体积百分比1%的接种量进行接种，将培养好的种子液转接到装液量为1L 的摇瓶中。37°C，180rpm培养至菌液在波长为600nm吸光度为0.8时，将培养条件改为20°C， 120rpm，继续培养30min后，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至浓度为O.lmM，继续培养24小 时；
[0120] LB液体培养基每升组分如下：
[0121] 10g NaCl，10g蛋白胨，5g酵母粉，蒸馏水定容至lL，pH 8.0。
[0122] 2.提纯 LfliZ 蛋白
[0123] (1)提纯蛋白所用的缓冲液为
[0124] 裂解缓冲液：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH8.0;
[0125] 冲洗缓冲液：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，50mM咪唑，ρΗ8·0;
[0126] 洗脱缓冲液：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，250mM咪唑，ρΗ8·0;
[0127] (2)10000rpm离心5min收集菌体，按照1L菌液收集的菌体用50mL裂解缓冲液的比 例加入裂解缓冲液重悬菌体，压力（lOOObar)破碎细胞；
[0128] (3)将步骤(2)得到的细胞破碎液，在4 °C温度下，12000rpm离心50min，去除不可溶 沉淀；
[0129] (4)将上述离心后的上清液，上样镍柱(每根镍柱装2mL镍胶）。待上清液流过镍胶 后，每根镍柱用20mL裂解缓冲液平衡，之后每根镍柱用20mL冲洗缓冲液冲洗。最后每根镍柱 用10mL的洗脱缓冲液洗脱蛋白，即得到提纯的目的蛋白Lf liZ。对提纯的LfliZ的SDS-PAGE 电泳分析如图2所示。
[0130] 经检测，蛋白LfliZ的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0131] 实施例3
[0132] 1.2' 环形核苷单磷酸混合物的提取
[0133] (1)将洗脱得到的目的蛋白LfliZ，0°C静置3d，此时蛋白溶液将会出现明显的沉 淀。将蛋白溶液12000rpm离心20min，得到上清液；
[0134] (2)将步骤（1)中得到的上清液，用截留分子量为3K的超滤管超滤，去除残留的蛋 白，超滤膜滤过液即为含有4种2' 环形核苷单磷酸溶液；
[0135] 2.四种环形核苷酸2' y-cAMPW y-cGMPW y-cCMP和2' y-cUMP纯品的提 取
[0136] (1)将得到的2' 环形核苷单磷酸溶液，采用C18反向色谱柱进行高效液相色谱 分离得到四种2'，3~环形核苷单磷酸纯品；
[0137] 所用的流动相为:A液，10mM醋酸铵溶液，pH 5.0;B液，75%A液加入25%甲醇；
[0138] (2)上述步骤中所用的分离程序为:Omin，B液0 % ; 2.5min，B液0% ; 5min，B液30 % ; 10min，B液60% ;14min，B液 100% ;21min，B液 100% ;22min，B液50% ;23min，B液0% ;30min， B液0%。流速为10mL/min，检测波长为254nm〇
[0139] 对上述4种2' 环形核苷单磷酸溶液进行HPLC分析，结果如图3所示，对上述4种 2'，3'-环形核苷单磷酸溶液进行液相色谱和质谱分析，结果如图4-7所示。
[0140] 3.四种纯品2'，3'_环形核苷单磷酸产量检测
[0141] (1)将购买的4种2' 环形核苷单磷酸标准品用蒸馏水稀释到如下浓度梯度:0μ 皿、2(^1、4(^1、6(^1、8(^1和10(^1，采用(：18反向色谱柱进行高效液相色谱检测各浓度的环形 核苷单磷酸标准品所对应的峰面积，之后以峰面积为横坐标，浓度为纵坐标绘制标准曲线。
[0142] (2)利用做好的标准曲线，将制备好的4种2'，3~环形核苷单磷酸样品用C18反向色 谱柱进行高效液相色谱分别检测浓度可得，每升培养液可提取1.30 ±0.17μπι〇1的2'，3'_ cCMP、1.40±0.12ym〇U92，，3，-cUMP、2.81±0.25ym〇U92，，3，-cGifl^P2.61±0.19ym〇U9 2 '，3 ' -cAMP。根据4种2'，3'-环形核苷单磷酸的分子量，将上述摩尔量换算成质量计算可 得，每升培养液可提取约2.5mg的四种纯品2 '，3 环形核苷单磷酸。
【主权项】
1. 一种海洋细菌基因 LfliZ，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. 权利要求1所述海洋细菌基因 LfliZ表达的重组蛋白LfliZ，氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。3. -种重组载体，在质粒中插入含有权利要求1所述海洋细菌基因 LfliZ。4. 如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述的质粒为pET-22b( + )质粒。5. -种重组细胞，将权利要求3所述重组载体转化入宿主细胞中获得。6. 如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为大肠杆菌;进一步优 选的，所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。7. 权利要求1所述海洋细菌基因 LfliZ在制备2'，3~环形核苷单磷酸中的应用。8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤如下： (1) 制备核酸序列如SEQ ID No. 1所示的海洋细菌基因 LfliZ; (2) 构建含有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的重组载体； (3) 构建含有步骤(2)所示重组载体的重组细胞； (4) 发酵培养上述重组细胞，经提取纯化，制得2 '，3 环形核苷单磷酸。9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)的重组载体采用的质粒为pET-22b( + )质粒;所述步骤(3)中的重组细胞采用的宿主细胞为大肠杆菌;进一步优选的，所述 的宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)。10. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中，发酵培养步骤如下： 先在35~38°C、150~200rpm条件下扩大培养至菌液在波长为600nm时的吸光度为0.8; 然后在18~22°C、100~140rpm继续培养25~35min;然后加入IPTG至浓度为O.lmM，继续诱 导培养22~25小时； 所述发酵培养采用的培养基为LB液体培养基，每升组分如下： 10g NaCl，10g蛋白胨，5g酵母粉，蒸馏水定容至lL，pH 8.0; 根据本发明优选的，所述步骤(4)中的提取纯化，步骤如下： (i)将发酵液经固液分离，取菌体，破碎菌体，固液分离，取上清液，经镍柱亲和层析，洗 脱后，制得目的蛋白LfliZ溶液； (ii )将步骤（i)制得的目的蛋白Lf 1 iZ溶液在-1~2°C静置2.5~3.5天，离心，取上清 液，经超滤，制得2 '，3 环形核苷单磷酸粗提液； (iii)将步骤(ii)制得的2'，3'_环形核苷单磷酸粗提液经C18反向色谱柱进行高效液相 色谱纯化，分别制得四种2 '，3 环形核苷单磷酸； 根据本发明进一步优选的，所述步骤(i)中采用镍柱亲和层析，步骤如下： 将破碎细胞后的上清液上样镍柱，每根镍柱装2mL镍胶，待上清液流过镍胶后，每根镍 柱用20mL裂解缓冲液平衡，用20mL冲洗缓冲液冲洗，最后用10mL的洗脱缓冲液洗脱，制得重 组蛋白LfliZ溶液； 所述裂解缓冲液组分为:50mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH8.0; 所述冲洗缓冲液组分为:50mM Tris-HCl、150mM NaCl、50mM咪唑，pH8.0; 所述洗脱缓冲液组分为:50mM Tris-HCl、150mM NaCl、250mM咪唑，pH8.0; 根据本发明进一步优选的，所述步骤（ii)中，超滤为采用截留分子量为3K的超滤管超 滤； 根据本发明进一步优选的，所述步骤（iii)中C18反向色谱柱进行高效液相分离的分离 程序为：〇min，B液0% ;2.5min，B液0%;5min，B液30%;10min，B液60% ;14min，B液 100% ; 21min，B液 100% ;22min，B液50% ;23min，B液0% ;30min，B液0% ;流速为 10ml/min，检测波 长为254nm; 流动相为:A液，10mM醋酸铵溶液，pH 5.0;B液，将A液与甲醇按体积比3:1的比例混合。
【文档编号】C07K14/195GK106086040SQ201610430027
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】陈秀兰, 张玉忠, 刘昂, 宋晓妍, 于洋, 李平, 李平一, 张熙颖, 石梅, 解彬彬, 苏海楠, 秦启龙
【申请人】山东大学