一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种miR-205基因敲除试剂盒，特别是一种基于 CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试剂盒。
【背景技术】
[0002] 1987年，日本大阪大学（OsakaUniversity)在对一种细菌编码的碱性磷酸酶 (alkalinephosphatase)基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在串联间隔 重复的DNA序列。2002年正式被科学家被称作"规律间隔成簇短回文重复序列"(Clustered RegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，CRISPR)〇
[0003]CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族，广泛分布于细菌和古细菌基因组中。 CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列（repeats)组成，重复序列的长度通常21~ 48bp，重复序列之间被26~72bp间隔序列（spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序 列与靶基因进行识别。Cas(CRISPRassociated)存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA 核酸酶，能在导向RNA(guideRNA，gRNA)的引导下对革EU立点进行切割。它与folk酶功能类 似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
[0004]CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，这些序列在被转录成为 RNA后，能够和细菌产生的一类称为Cas的蛋白质形成复合体，来对Cas蛋白起到导向作用， 因此这段RNA也被称为导向RNA。当复合体检测到入侵的DNA和gRNA序列一致时，Cas蛋 白就能够切割入侵的DNA，达到防御的目的。2013年以后，研究者们在包括《science》和 《naturebiotechnology》等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在 人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。
[0005] CRISPR-CAS9是一种最新基因组定向基因编辑技术，是来源于细菌获得性免疫的 由RNA指导Cas9蛋白对靶向基因进行修饰的技术。在改造后的CRISPR-CAS9系统中，sgRNA 通过与靶位点结合引导CAS9蛋白识别PAM序列，同靶基因结合在PAM区上游对基因组DNA 进行切割，从而造成双链断裂，引发非同源末端连接修复。在修复过程中个别碱基的缺失或 插入会造成移码突变，从而达到基因组定点编辑的目的。
[0006]miRNA是一组保守的非编码小RNA(non-codingsmallRNA)，长约22nt的非编码 的单链RNA分子，广泛分布在病毒、植物到高等哺乳动物中，大约相当于每种生物体蛋白编 码基因的1%。目前，miRNA已知的功能是在转录后水平调控基因的表达，主要作为基因表 达的负调控因子，即通过抑制靶基因的翻译而起调控作用。
[0007]miRNAs的表达具有时空特异性，即miRNAs在处于不同的发育阶段的细胞中和处 于同一发育阶段的不同细胞中的表达谱各不相同。同时，miRNAs的表达谱不仅仅指miRNAs 的种类，也指各种miRNAs的丰度，直接反映了细胞组织的信号调控状态。近年的研究表 明，miRNA表达失调与多种肿瘤相关，并且这些miRNA可能起肿瘤抑制基因或癌基因的作 用。Brio等运用基因芯片及Northernblot等实验方法，检测到乳腺癌组织中miR2125b、 miR2145、miR221 和miR2155 等多种miRNA的紊乱表达，其中miR210b、miR2125b和miR2145 高表达，而miR221和miR2155低表达。这些miRNA与肿瘤的分期和雌、孕激素的表达、血管 侵袭性及肿瘤细胞增殖均相关。因此人们推测miRNA表达改变与肿瘤发生密切相关，它们 常常定位于肿瘤相关区域，可能同时具有癌基因和抑癌基因的双重作用。当miRNA过度表 达时，抑制了抑癌基因的表达；而miRNA表达过少或缺失时，则不能有效地抑制癌基因。其 中最为突出的成果表现在miR-21与肿瘤的关系，2006年Meng等确证了miR-21的一个革巴基 因是PTEN，PTEN是肿瘤抑制基因；同时miR-21是靶基因之一，miR-21通过直接抑制PTEN 的表达，从而激活PI-3激酶信号传导通路，调节细胞凋亡。总之，miRNA广泛参于肿瘤的发 生和发展。
[0008] miR-205于2007年被证实了在人类细胞中存在，它的基因定位于人的第1号染色 体的长臂上，长度为110个碱基。现已发现miR-205与多种肿瘤都有密切的关系，其中包括 前列腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、子宫内膜及肾上腺皮质癌等。GanddliniP等在前列腺癌 中发现：miR_205在发生上皮间质转化（Ephhelial-to_mesenchymal，EMT)的肿瘤细胞中下 调，而miR-205表达的增加可以抑制EMT过程中的一些重要蛋白mRNA的翻译，从而抑制肿 瘤的侵袭转移过程。ShahanaMajid等证实miR-205能够抑制Src激酶家族成员Src、Lyn和 Yes的表达，从而抑制Src激酶家族碟酸化调节的ERK1/2通路，而ERK1/2通路可以对肿瘤 的增殖进行调控，因此miR-205可以抑制肿癌细胞的增殖。最近有研究证实miR-205是抑制 黑色素瘤细胞迀移的一个关键因素，而在人类胶质母细胞瘤中，miR-205通过靶向VEGF-A 而发挥肿瘤抑制基因的作用。这些都表明miR-205与肿瘤的发生、发展存在密切的联系。
【发明内容】
[0009] 本发明目的在于提供一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试 剂盒，该试剂盒能高效、快速、方便地敲除miR-205基因，应用于miR-205基因敲除细胞、动 物模型的构建、相关通路的研究及药物开发。
[0010] 本发明所述的一种基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试剂盒， 包括：（1)质粒miR-205-Cas9,其含有一段互补的DNA序列，该DNA序列能被转录为特异识 别序列如SEQIDN0:2所示的miR-205基因的革E标序列的sgRNA(shortguideRNA)，该 sgRNA与trRNA(trans-activatingRNA)构成特异的识别结构，从而引导Cas9酶特异地剪 切miR-205基因对应序列；（2)检测试剂，用于检测miR-205基因的剪切效果，并可评估基 因敲除效率。
[0011] 根据本发明所述的miR-205基因敲除试剂盒的进一步特征，所述互补的DNA序列 为：SEQIDNo:6 和SEQIDNo:7。
[0012] 根据本发明所述的miR-205基因敲除试剂盒的进一步特征，所述质粒 miR-205-Cas9是用包括如下步骤的方法构建的：以PXC9-puro质粒为起始载体，先用Bbsl 酶切并回收骨架；设计合成SEQIDN〇:6和SEQIDN〇:7两个带有接头的核苷酸序列，合成 好后稀释并退火作为插入片段；用T4DNA连接酶在16°C连接2h将骨架和接入片段接上，挑 克隆测序鉴定，获得表达质粒PXC9-pur〇-miR205-sgRNA。
[0013] 根据本发明所述的miR-205基因敲除试剂盒的进一步特征，所述检测试剂为T7E1 酶切试剂，将PXC9-pur〇-miR205-sgRNA转染LNCap细胞，持续药筛、荧光检测，得到表达 细胞株。提取细胞DNA，扩增引物miR-205并纯化，通过将PCR产物变性，再退火的方式形成 异源杂交双链，利用T7E1酶切试验确定CRISPR-Cas9系统对miR-205的剪切效率。
[0014] 本发明所述的基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试剂盒具有以 下特点和优点：利用CRISPR-Cas9系统，设计了一段sgRNA来特异识别miR-205基因，最终 导致其功能失活。
[0015] 本发明所述的基于CRISPR-Cas9基因敲除技术的miR-205基因敲除试剂盒可用于 定向miR-205基因的敲除，具有高效、快速、简单经济等特点，对于miR-205基因敲除动物模 型及相关通路的研究具有重要意义。
【附图说明】
[0016] 图1是sgRNA和Cas9酶结合并特异识别剪切miR-205的作用示意图。
[0017] 图2是miR-205-Cas9质粒示意图。
[0018] 图3是PXC9_puro载体酶切电泳结果图。
[0019]
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式 通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明 的主要特征可以用于各种实施方式。
[0021] 实施例1 :载体构建
[0022] (1)miR-205靶标优化设计
[0023]针对miR-205 基因（基因名MIR205,基因ID号：406988，11?口：/^^￥.11吐1.111111. nih.gov/gene/406988)，在GeneBank网站检索并下载获得miR-205基因组序列（SEQID N0:1)：
[0024] 5'-AAAGATCCTCAGACAATCCATGTGCTTCTCTTGTCCTTCATTCCACCGGAGTCTGTCTCATACCC AACCAGATTTCAGTGGAGTGAAGTTCAGGAGGCATGGAGCTGACA-3，
[0025]利用在线软件FengZhanglab'sTargetFinder(http://crispr.mit.edu/)及 DNA2.OgRNA设计工具软件（https://www.dna20.com/eCommerce/cas9/input)设计sgRNA， 输入上述miR-205序列，设置并检索获得最优的靶序列。选择两个软件均推荐的靶序列，共 选择最优的4个靶序列，具体如下表：
[0026] 表 1 [00?71
[0028] (2)合成靶标片段
[0029] 上述设计优化的祀标拟克隆到PXC9_puro载体，该载体来源ZhangLabCRISPR Plasmids，购于Addgene公司（货号#52963)。将革E标序列加上载体Bbsl酶酶切的粘性连 接未端。送上海捷瑞公司合成单链核苷酸链。
[0030] 4.在3￡〇10勵:2序列加上接头，得到插入片段11111?-205881?熟1 :
[0031]sgRNAl-Fl:5' -caccgTCTCTTGTCCTTCATTCCAC-3'（SEQIDNo:6)
[0032]sgRNAl-Rl：5,-aaacGTGGAATGAAGGACAAGAGAc(SEQIDNo: 7)
[0033] 含接头的miR-205-sgRNA引物
[0034] 8.在3￡〇10勵:3序列加上接头，得到插入片段11111?-205881?熟2 :
[0035]sgRNA2-F2 :5,-caccgCATACCCAACCAGATTTCAG-3'（SEQIDNo:8)
[0036]sgRNA2-F2 :5,-aaacCTGAAATCTGGTTGGGTATGc-3，（SEQIDNo:9)
[0037] C?在SEQIDN0:4序列加上接头，得到插入片段miR-205sgRNA3 :
[0038]sgRNA3-F3 :5'-caccgATTTCAGTGGAGTGAAGTTC-3'（SEQIDNo:10)
[0039]sgRNA3-F3 :5'-aaacGAACTTCACTCCACTGAAATc-3'（SEQIDNo:ll)
[0040] 0.在3￡〇10勵:5序列加上接头，得到插入片段11111?-205881?熟4 :
[0041] sgRNA3-F4 :5'-caccgTCAGTGGAGTGAAGTTCAGG-3'（SEQIDNo:12)
[0042]sgRNA3-F4 :5'-aaacCCTGAACTTCACTCCACTGAc-3'（SEQIDNo:13)
[0043] 将每组miR-205-sgRNAF与miR-205-sgRNAR分别等体积混合后，沸水浴中煮沸 5min，然后72°C15min，自然冷却至室温，约60min。此时即可与载体连接，或-20°C保存。
[0044] (3)载体酶切
[0045] 在无菌的0. 2mLEP反应管，取PXC9-puro载体15yL，用Bbsl酶切，酶切体系如 下：
[0046]
[0047] 混匀后，37°C反应2h以上。Bbsl购买于NEB公司，此酶说明书的酶切时间是15分 钟，但我们延长酶切时间让其反应更充分。载体酶电泳结果见图3。（4)酶切产物回收（DNA 凝胶回收试剂盒，购于东胜科技）
[0048]1)酶切产物经1%凝胶电泳后，在紫外灯下，用手术刀切取载体的凝胶条带至干 净的1. 5mLEP管中，按100mg凝胶对应100yL溶液BD的比例向离心管中加入溶液BD。
[0049] 2)60°C水浴lOmin至凝胶完全溶化，水浴期间振荡混合3次。
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