使用壮观霉素选择的植物转化方法

使用壮观霉素选择的植物转化方法
【专利说明】使用壮观霉素选择的植物转化方法
[0001] 本申请是申请日为2008年3月10日、申请号为200880012913. 8、发明名称为"使 用壮观霉素选择的植物转化方法"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 发明背景
[0003] 本申请要求于2007年3月9日提交的美国临时申请60/894, 096和2007年4月 30日提交的美国临时申请60/915, 066的优先权，本文完整引入其公开内容作为参考。 1.发明领域
[0004] 本发明主要涉及制备和转化植物分生组织及转基因植物的选择和随后的再生的 方法。
[0005] 2.相关技术描述
[0006] 可以通过直接处理植物胚的分生组织获得转化的植物。分生组织包含形成性植物 细胞，形成性植物细胞分化产生多种植物结构，包括茎、根、叶、种系组织和种子。可以从种 子切下如大豆组织的分生组织。已知直接对大豆胚的分生细胞使用细菌介导的基因转移 来遗传转化大豆（Glycinemax)的方法。已经转化了分离的棉花分生组织和苗端（shoot apex)组织。已报道了细胞分裂素在组织培养中诱导苗发育的用途。
[0007] 已知许多用于遗传转化植物细胞的选择剂。氨基糖苷-3'-腺苷酰转移酶已被用 作转化植物细胞中的选择性标记。已经报道了aadA与编码叶绿体转运肽的序列的融合，以 允许将核产生的AadA引向叶绿体。
[0008] 发明概沐
[0009] -方面，本发明提供了产生包含至少两种异源核酸序列的转基因植物的方法，包 括：(a)提供包含赋予除草剂抗性的第一异源核酸序列的外植体；(b)转化该外植体以包 括含有赋予壮观霉素抗性的可选择标记基因的第二异源核酸序列；和（c)再生显示壮观 霉素抗性的外植体成为包含至少两种异源核酸序列的转基因植物。在一个实施方案中，外 植体包含胚分生组织。在另一个实施方案中，第一异源核酸序列赋予对草甘膦、双丙氨膦 (bialaphos)、草胺膦（phosphinothricin)、Basta、草丁膦、2,4_D、卡那霉素和相关的氨基 糖苷类、潮霉素（hygromycin)、乙酰辅酶A羧化酶抑制剂、产氧自由基物质或麦草畏的抗 性。在另一个实施方案中，外植体是大豆、玉米、棉花或油菜（canola)外植体。在一个特定 的实施方案中，外植体是大豆或棉花外植体，如大豆植物。
[0010] 另一方面，本发明提供了产生转基因植物的方法，包括：(a)用包含赋予壮观霉素 耐受性的可选择标记的异源核酸序列转化至少第一种子外植体；和（b)从转化的细胞再生 转基因植物，其中在步骤（a)或步骤（b)之前、同时和/或之后，将外植体与包含壮观霉素 的至少第一培养基接触，以选择包含所述可选择标记的转化细胞。在一个实施方案中，转 基因植物由导致种系组织转化的分生组织的转化产生。在某些实施方案中，产生的植物是 非嵌合的。在另外其它的实施方案中，产生的植物是嵌合的。在一个特定的实施方案中， 产生的植物的至少一个苗（shoot)是转基因且非嵌合的。在另一个特定的实施方案中，产 生的植物的至少一个苗是转基因且非嵌合的，而至少一个其它苗或一个其它根不包含在异 源核酸上所含的序列。在某些实施方案中，第一种子外植体包括转基因。在其它实施方案 中，外植体包含胚分生组织。在另外其它的实施方案中，在步骤（a)的过程中或之后，在 35°C-40°C下，在选择剂的存在下培育外植体，和/或在允许正常质体发育的光照条件下培 育外植体。在另外其它的实施方案中，在35°C-40°C下，培育进行1-7天，或者光照条件包 括至少5微爱因斯坦（yEinsteins)、大约16小时光照/8小时黑暗的光周期。
[0011] 在某些实施方案中，在步骤（a)之前，在0-15°C的温度下存储外植体1小时至7 天。在其它实施方案中，培养基包含大约15mg/L-大约1500mg/L的壮观霉素。本发明进一 步涉及一种方法，其中外植体的细胞包含赋予对草甘膦、双丙氨膦、草胺膦、Basta、草丁膦、 2,4-D、卡那霉素和相关的氨基糖苷类、潮霉素、链霉素、氨苄青霉素或麦草畏的耐受性的编 码序列。在某些实施方案中，步骤（a)包括在包含壮观霉素的共培养基上培育外植体。在其 它实施方案中，在从共培养基中转移出后，外植体不与包含壮观霉素的培养基接触。或者， 在其它实施方案中，在从共培养基中转移出后，外植体与包含壮观霉素的培养基接触。在某 些实施方案中，无需在无菌培养基中预生根，将再生成为植物的外植体转移到土壤或土壤 替代物中生根。在其它实施方案中，异源核酸进一步包括赋予农艺学上的目标性状或具有 改善的最终用途的性状的编码序列。
[0012] 在其它实施方案中，本发明提供了产生转基因植物的方法，包括：(a)用包含赋予 壮观霉素耐受性的可选择标记的异源核酸序列转化至少第一种子外植体，和（b)从转化 的细胞再生转基因植物，其中在步骤（a)或步骤（b)之前、同时和/或之后，将外植体与 包含壮观霉素的至少第一培养基接触，以选择包含所述可选择标记的转化细胞，其中，步 骤（a)包括用至少第二异源核酸转化外植体的细胞。在特定的实施方案中，第二异源核酸 序列包含赋予除草剂耐受性的编码序列。在某些实施方案中，第一和第二异源核酸整合在 细胞基因组中的不同的基因座处。本发明的某些实施方案包括，在步骤（a)之前的引发 (priming)种子的步骤，其中，引发包括将种子与细胞分裂素接触。在其它实施方案中，涉及 一种方法，进一步包括在步骤（b)之前、同时和/或之后，将外植体与细胞分裂素接触。在 特定的实施方案中，细胞分裂素选自噻苯隆（thidiazuron)、BAP(6-节氨基噪呤）、激动素、 CPPU(N- (2-氯-4-吡啶基）-N' -苯脲）、2iP(6- (y，y-二甲基烯丙基氨基）嘌呤）、玉米素、 玉米素-核苷、腺嘌呤和TIBA(2, 3, 5-三碘苯甲酸）。
[0013] 在某些实施方案中，步骤（a)包括将外植体与包含所述异源核酸的重组根瘤菌科 细菌（Rhizobiaceae)接触，其中，在外植体接触重组根瘤菌科细菌之前或同时，根瘤菌科 细菌已经暴露于噻苯隆。在某些实施方案中，在外植体接触重组根瘤菌科细菌之前，根瘤菌 科细菌暴露于噻苯隆大约1-5天。在其它实施方案中，在外植体接触根瘤菌科细菌之前，在 对未转化的外植体具有活性的选择剂的存在下，悬浮根瘤菌科细菌。在某些实施方案中， 根瘤菌科细菌选自土壤杆菌（Agrobacteria)、中华根瘤菌（Sinorhizobia)、中慢生根瘤菌 (Mesorhizobia)和根瘤菌（Rhizobia)。在另外其它的实施方案中，在用包含赋予壮观霉 素耐受性的可选择标记的异源核酸序列转化至少第一种子外植体的步骤之前、过程中或之 后，在杀真菌剂的存在下培育外植体。在某些实施方案中，在杀真菌剂和DMS0的存在下培 育外植体。在特定的实施方案中，在制霉菌素（nystatin)、噻菌灵（thiabendazole)和DMS0 的存在下培育外植体。
[0014] 在某些实施方案中，外植体是大豆、玉米、棉花或油菜外植体。在特定的实施方案 中，外植体是大豆外植体或棉花外植体。
[0015] 在某些实施方案中，产生转基因植物的方法包括：(a)用包含赋予壮观霉素耐受 性的可选择标记的异源核酸序列转化至少第一种子外植体，和（b)从转化的细胞再生转基 因植物，其中在步骤（a)或步骤（b)之前、同时和/或之后，将外植体与包含壮观霉素的至 少第一培养基接触，以选择包含所述可选择标记的转化细胞，进一步包括步骤（c):获得包 含赋予目标性状的基因且缺乏可选择标记的任一代转基因植物的后代植物。在某些实施方 案中，异源核酸包括包含位于赋予目标性状的基因侧翼的左和右T-DNA边界的第一DNA区 段；和包含第二套位于所述赋予壮观霉素耐受性的可选择标记侧翼的左和右T-DNA边界的 第二DNA区段。在其它实施方案中，该方法进一步包括步骤（c):获得包含赋予目标性状的 基因且缺乏可选择标记的任一代转基因植物的后代植物。
[0016] 在某些实施方案中，异源核酸包括右和左T-DNA边界及第一和第二DNA区段，其 中，第一DNA区段包括位于右边界之后的目标基因，而且其中，第二DNA区段包括位于左边 界之后的可选择标记。在某些实施方案中，异源核酸包括第一和第二右T-DNA边界，其中， 包含目标基因的第一DNA区段位于第一右边界之后，且包含可选择标记的第二DNA区段位 于第二右边界之后。
[0017] 在某些实施方案中，该方法包括在步骤（b)的过程中，在缺乏壮观霉素的培养基 上培养所述外植体大约1天至大约7天。在其它实施方案中，该方法包括将外植体与包含 壮观霉素的至少第一培养基接触大约15分钟至大约7天。在特定的实施方案中，可选择标 记由aadA编码。在更加特定的实施方案中，aadA包括SEQIDN0:1。在某些实施方案中， aadA基因与叶绿体转运肽融合。在特定的实施方案中，aadA包括SEQIDN0:2。
[0018] 在某些实施方案中，进一步限定外植体在步骤（b)前、在以下条件下维持：其中， 外植体不发芽，并且保持存活且能够进行遗传转化。在某些实施方案中，所述条件包括使外 植体或包含外植体的种子脱水。在某些实施方案中，进一步限定该方法为包括在步骤（b) 之前或同时增加外植体的含水量。在特定的实施方案中，所述条件包括大约3%-大约25% 的外植体的内部含水量。在更加特定的实施方案中，所述条件包括大约3% -大约16%的 外植体的内部含水量。在某些实施方案中，所述条件包括在大约_80°C-大约60°C的温度 下维持外植体。
[0019] 在某些实施方案中，该方法包括在步骤（b)之前引发外植体。在特定的实施方案 中，引发种子包括将外植体或包含外植体的种子与包含水、植物生长调节剂、选择剂或细胞 膜调节剂的水溶液接触。
[0020] 在某些实施方案中，包括产生转基因植物的方法，包括：(a)用包含赋予壮观霉素 耐受性的可选择标记的异源核酸序列转化至少第一种子外植体；和（b)从转化的细胞再生 转基因植物，其中在步骤（a)或步骤（b)之前、同时和/或之后，将外植体与包含壮观霉素 的至少第一培养基接触，以选择包含所述可选择标记的转化细胞，该方法进一步包括通过 细菌介导的转化或微粒轰击，用异源核酸转化外植体的至少第一细胞。
[0021] 在某些实施方案中，进一步限定外植体为从包含3% -25%的内部含水量的种子、 或包含26% -80%的内部含水量的水化的或发芽的种子上切下的，或者外植体包含以下组 织：分生组织、不成熟的胚、胚、胚轴、子叶、下胚轴（hypocotyl)、中胚轴（mesocotyl)、叶、 初生叶原莖（primaryleafbase)、叶盘（leafdisc)、莖尖（shoottip)和胚芽（plumule)。 在某些实施方案中，进一步限定外植体为从发芽或吸胀的种子上切下的。在其它实施方案 中，在步骤（a)之后，外植体不与包含壮观霉素的培养基接触。在特定的实施方案中，第一 培养基是液体。在其它实施方案中，步骤（a)-(b)中的一个或多个是自动化的。
[0022] 另一方面，本提供了包含赋予壮观霉素或链霉素耐受性的两种序列的核酸构建 体，其中，第一序列可操作地连接到在植物细胞中具有活性的启动子上，且第二序列可操作 地连接到在原核细胞中具有活性的启动子上。在一个特定的实施方案中，赋予壮观霉素或 链霉素耐受性的序列编码具有氨基糖苷_3'_腺苷酰转移酶（aadA)活性的多肽。在一个更 特定的实施方案中，至少一个序列包含SEQIDN0 :1或SEQIDN0 :2。
[0023] 附图简沐
[0024] 下面的附图是本说明书的一部分，而且包括在说明书中以进一步证明本发明的某 些方面。通过参考附图结合本文提出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
[0025] 图1:用添加到接种物/共培养培养基中的不同水平的TDZ处理后，4种大豆外植 体的放大的细节。每种外植体发育出新生的芽/苗（下图），而一些是GFP阳性的（上图）。 上排的图片是在显微镜下用通过荧光检测表达GFP的组织的改变的蓝光源采集的。用标准 白光源采集同样的图片，以显示所有的发育的芽/苗（下排）。
[0026]图 2 :pM0N96999 的质粒图。
[0027] 图3:壮观霉素选择方案"A"的略图。在液体或半固体培养基上的选择、苗诱导和 延长；使分离的苗在半固体培养基上生根。
[0028] 图4:壮观霉素选择方案"B"的略图。在液体或半固体培养基上的选择、苗诱导和 延长；无需选择，使分离的苗在具有液体培养基的OASIS塞（plug)中生根。
[0029] 图5:壮观霉素选择方案"C"和"D"（下图）的略图，以及与使用草甘膦选择的方 案的比较（上图）。对于方案"C"，在共培养之后，保持外植体在原始的PLANTCONs中，并加 入12ml液体选择培养基。4天后，将它们转移到用于选择和苗诱导的半固体选择培养基上。 对于方案"D"，在共培养之后，将外植体直接转移到用于选择和苗诱导的半固体培养基上。 在方案"C"和"D"中，无需对于苗延长和根诱导进行选择，将产生绿苗的外植体移到具有液 体培养基的Oasis?.塞中。对于使用草甘膦选择的方案（上图），其中，苗诱导和苗延长在 半固体培养基上进行并进行选择，分离的苗的生根也在半固体培养基上进行并进行选择。
[0030]图 6:包含 2 个T-DNA、OriRi和aadA的pM0N107379 的质粒图。
[0031] 发明详沐
[0032] 下面是本发明的详述，用以帮助本领域的技术人员实践本发明。本领域的技术人 员可以在不背离本发明的精神或范围的情况下，对本文所述的实施方案进行修改和改变。
[0033] 本发明提供了使用壮观霉素作为选择剂从大豆、玉米、棉花、或油菜植物等制备、 筛选、转化和再生外植体，以获得转化的植物组织和植物的方法和组合物。在某些方面，所 述方法的各个部分可以是自动化、高通量的程序。例如，从种子获得如成熟的或不成熟的胚 的外植体，并可通过例如细菌介导的方法或微粒轰击方法转化该外植体。在某些实施方案 中，在异源DNA接触外植体的时候或随后，外植体接触选自噻苯隆、BAP(6-苄氧基嘌呤）、激 动素、CPPU(N- (2-氯-4-吡啶基）-N' -苯脲）、2iP(6- (y，y-二甲基烯丙基氨基）嘌呤）、玉 米素、玉米素-核苷、腺嘌呤和TIBA(2，3，5-三碘苯甲酸）的细胞分裂素或其它类似敌草克 (dikegulac)的试剂。为了有助于外植体与细胞分裂素的接触，可以在外植体接触接种物 之前向用于转化的细菌接种物中加入细胞分裂素。在某些实施方案中，所用的细胞分裂素 是大约〇-3mg/L或大约0? 25-3mg/L的浓度的BAP或TDZ(大约0-3mg/l或大约0? 25-3mg/ L)。在某些实施方案中，也可以在种子吸胀过程中加入细胞分裂素或其它试剂，以在切下外 植体之前处理它们。
[0034]涉及在用或不用细胞分裂素处理的情况下，以15_1500mg/L的浓度使用壮观霉 素，例如，大约25、50、100、150、250、300、500、1000或1500mg/L。如果使用细菌介导的转化 的方法，可以在其接触外植体之前向细菌接种物中加入壮观霉素。或者，如果使用细菌介导 的转化方法或微粒轰击转化方法，可以在转化大豆、玉米、棉花或油菜细胞的步骤之前、同 时或之后加入壮观霉素，以选择被异源核酸转化的细胞。也可以采用壮观霉素作为所述组 织培养生长步骤的时间段中的一部分的"脉冲"，如预培养步骤、共培养步骤、延迟步骤或选 择步骤，且任选地以大约l〇〇〇mg/L的较高浓度使用。
[0035]在现有技术中，使用本文所述的方法和组合物没有实现获得的转化率（"TF")。因 此，相比例如使用草甘膦或麦草畏作为大豆或棉花转化的选择剂时发现的TF，已经实现了 2-10或5-10倍的TF增加（在某些情况下甚至更高）。另外，提高的转化效率允许开发使 用大观霉素选择的有效的2T-DNA转化系统，因此允许通过转化叠加转基因性状，并且使已 经包含一种转基因性状的植物与编码另外的目标性状的核酸杂交，然后筛选也包含编码该 另外的性状的核酸的植物。
[0036]与TF的提高相结合，所述方法在简化并减少产生转化的植物必需的劳动力的同 时，也允许更快速地再生候选的转化植物组织，提高鉴定和培育转化的苗和植物的效率，和 减少成本和人类工程学（ergonomic)负担。例如，在具有绿色的（S卩，大观霉素抗性的）芽 或叶的大观霉素抗性苗已经伸长并且可以筛选或评分为大观霉素抗性之后，在存在或不存 在选择剂的情况下，可以将它们置于土壤中或如生根培养基的土壤替代物上。从这种外植 体伸长的苗常规地证明为转基因的，并产生&和转基因的后代，而从这样的外植体发育的 根可以是转基因或非转基因的。因此，也涉及包含转基因苗和部分或完全非转基因的根系 统的植物。也涉及这样一种方法：通过在缺乏选择剂的培养基上培养转化的组织，从来自转 化的分生组织的转基因苗再生完整的植物，尽管根是非转基因的。因此，所述方法使得在选 择条件下和使用选择剂的情况下的耗时明显减少，因而也减少了可能的费用。
[0037]为了提供对于说明书和权利要求书的清楚和一致的理解，包括这些术语的范围， 提供了下面的定义。
[0038]"胚"是种子的部分，由叶、茎和根的前体组织（分生组织）组成。一旦胚开始生长 (发芽），则变成幼苗植物。
[0039] 分生组织（"Meristem"或"meristematictissue"）由未分化细胞、分生组织细 胞组成，其分化产生多种植物结构，包括茎、根、叶、种系组织和种子。分生组织细胞是为了 获得转基因植物的转化的靶标。
[0040]"外植体"是用于表示转化的靶标材料的术语，包括分生组织。它可以指植物组织， 包括但不限于一个或多个胚、子叶、下胚轴、叶基、中胚轴、胚芽、原生质体和胚轴。
[0041]"嵌合植物"是由遗传学上不同的组织组成的植物，g卩，该植物只有一部分组织是 转化的，而其余的组织不是遗传转化的。
[0042]当目标基因转化到产生花粉或胚珠的细胞中进而转化到种子中时，发生了 "种系 转化"。
[0043] 为了获得转基因后代植物，可以用选择的异源DNA序列转化外植体，且可以由此 再生转基因植物，而无需从转化的外植体产生愈伤组织细胞培养物。例如，选择的异源DNA 序列可以编码可筛选或可选择的标记，和/或包含提供由异源核酸表达而产生的植物或细 胞所显示的性状的农艺学目标基因。性状可以是农艺学上有用的，例如，导致提高的产量、 除草剂耐受性、害虫或病原体抗性或环境适应性等表型。性状也可以确定需要的终产物的 产生。
[0044] 这样的转化和再生方法允许用于产生转化植物的快速有效的高通量程序。机械化 明显减少产生10, 〇〇〇个外植体预计的需要的工时，例如在棉花的例子中，从大约40小时减 少到只有2. 4小时，明显节约了劳动力成本。由于预期只有非常少量的转化事件显示最理 想的适于商业开发的表达谱，因此这种技术允许测试大量的转基因并选择较高质量的事件 用于进一步的分析。由于在外植体递送方面的灵活性增加，机械切除方法也允许对转化步 骤进行更好的时间安排和调度。外植体切除使用机械化方法可以提供明显的经济、安全和 灵活性方面的益处。但是，也可以手工进行外植体制备。
[0045] 在吸胀、发芽和/或外植体切除之前，可以对种子进行灭菌步骤以及挑选步骤，以 避免微生物污染，除去具有高度细菌或真菌污染的种子，以及除去由于任何原因不可能产 生用于本发明的活外植体组织的种子。例如，可以根据如种子的大小、颜色或密度等参数 或包括化学组成特征的其它特征，进行挑选。挑选方法的例子可以包括在大小分选后使用 自动称。适于此目的的光学分选器是Sortex3000SeriesColorSorter(Buhler_Sortex KK，Yokohama，Japan)。也可以采用其它挑选技术，包括根据含水量挑选。切除后，在用异源 核酸转化之前，外植体也可以进行再水化或预培养步骤。
[0046] 在特定的实施方案中，使用可以反向旋转的、碾压施加到其表面的种子的乳辊 (roller)进行机械切除。可以根据施加的种子的大小调整乳辊之间的间隙。乳辊材料 可以是例如弹性体或金属。在某些实施方案中，已经发现甚至在反复和持续使用后，不锈 钢乳辊保持有效的工作质量。发现当用于棉花种子时，具有次级凹槽的乳辊有效地夹紧 和碾压种子，而对分生组织外植体种子部分具有最小的损伤。已知机械切除植物外植体 的方法，例如，参见，美国临时专利申请60/894, 096和60/915, 066与美国专利申请公开 US2005/0005321，本文完整引入作为参考。
[0047] 在一个实施方案中，可以限定根据本发明制备的外植体具有大约4-25%的内部含 水量，包括大约 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24 和 25%的内 部含水量，而且特别包括在任意两个这样的数值之间的可推导出的所有范围。在特定的实 施方案中，可以以预定的适合由此分离可转化的材料的内部含水量，收获将要从其制备外 植体的种子。在某些非限制性的实施方案中，从其获得外植体的种子可以限定为具有大约 3-25%的内部含水量，包括大约 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、2