一种橡胶树γ谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物工程领域，具体涉及一种橡胶树Y谷氨酰半胱氨酸合成酶 的编码基因及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 橡胶是一种以聚异戊二烯为主要成分的天然高分子化合物，而通常我们所说的天 然橡胶，是指从巴西橡胶树上采集的天然胶乳，经过凝固、干燥等加工工序而制成的弹性固 状物，有很强的弹性和良好的绝缘性、可塑性、隔水隔气、抗拉和耐磨等特点，广泛地运用于 工业、农业、国防、交通、运输、机械制造、医药卫生等各个领域。目前我国天然橡胶自给率仅 达20 %，依赖大量进口，依据海关总署公布的数据，2015年仅6月份进口量即高达1. 6万 吨，因此如何提高天然橡胶产量一直是本领域科研的主要方向。
[0003] 排胶持续时间是限制胶乳产量的因素之一，研究发现，割胶后橡胶树乳管中能产 生大量的活性氧，活性氧可促使黄色体膜氧化破裂，从而导致胶乳在乳管中原位凝固停止 产胶。硫醇是存在于乳管细胞中的一类抗氧化剂，具有延迟胶乳凝固的作用，与排胶持续时 间密切相关，因此它们作为抗氧化剂，能抵抗乳管细胞中产生的活性氧对乳管细胞膜系统 的破坏作用（Xiaoetal. , 2001.Xiao,X.Z. .Discussionofethrelhurtandproduction mechanisminrubbertree.Tropicalagriculturalscienceandtechnology 2000, 7-11.)。在橡胶树胶乳中，硫醇的主要成分是谷胱甘肽（GSH)，半胱氨酸能被直接 合成蛋白和谷脫甘肽（Davidianetal.，2010Davidian，J.C. ;Kopriva，S.Regulation ofsulfateuptakeandassimilation-thesameornotthesame?Molecular plant2010, 3, 314-325.)。生物体内的谷胱甘肽（GSH)是在y-谷氨酰半胱氨酸合成 酶（y-glutamylcysteinesynthetase，简称y-ECS)及谷脫甘肽合成酶（glutathione synthetase，简称GS)的催化作用下，通过两个依赖ATP提供能量的反应，利用谷氨酸、半胱 氨酸和甘氨酸合成的。Y-ECS是谷胱甘肽合成过程中的限速酶，细胞内y-ECS活性升高可 促使半胱氨酸合成加速，进而提高细胞内外GSH浓度。目前，y-ECS基因及酶活性在橡胶 树研究中尚未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种橡胶树y谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因及其制 备方法和应用。
[0005] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0006] -种橡胶树y谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因，所述编码基因为SEQIDNo:1 所示的核苷酸序列。
[0007] 本发明中，优选的方案为所述SEQIDN〇:l所示的核苷酸序列中自5'端第 224-1795位的碱基序列为编码基因的开放阅读框。
[0008] 本发明还提供该橡胶树Y谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因的制备方法，包括 如下步骤：
[0009]a.EST片段克隆：以热研8-79品种的巴西橡胶树胶乳RNAoligo-d⑴18反转录 得到的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到EST片段，所述ETS片段为SEQIDNo: 2所示的核 苷酸序列，其中PCR扩增使用的引物对为：
[0010]上游引物：5'-TTCCAAGAGGGTGGGTAA-3'；
[0011]下游引物：5' -AAAGCAAGACCAGCGTGA-3'；
[0012] b. 5'端RACE:利用步骤a得到的EST片段设计5'端巢式引物，然后进行5'端RACE 的PCR扩增，得到序列-5-RACE，所述序列-5-RACE为SEQIDNo: 3所示的核苷酸序列，所述 5'端巢式引物的序列如下：
[0013] 5 'RACE-GSP:5'-CTCAGAACTGAAATCCAGATTAAC-3' ；
[0014] 5'RACE-NSP:5'-TCTGCTTTCCCTGTTTGAGTCCTAT-3' ；
[0015]c. 3'端RACE:利用步骤a得到的EST片段设计3'端巢式引物，然后进行3'端RACE 的PCR扩增，得到序列-3-RACE，所述序列-3-RACE为SEQIDNo: 4所示的核苷酸序列，所述 3'端巢式引物的序列如下：
[0016] 3 'RACE-GSP:5'-AAACAGGGAAAGCAGAGCA-3' ；
[0017] 3 'RACE-NSP:5'-ACATGCACTGTCCAGGTTAA-3'；
[0018]d.cDNA全长克隆：将步骤a、b、c得到的三条序列进行拼接，即得SEQIDNo: 1所 示的核苷酸序列。
[0019] 本发明的所述的橡胶树Y谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因的制备方法，优选 的方案为：
[0020] 所述a步骤中每25yl的PCR反应体系为：10父131^€612.5111，浓度为2.5臟〇1/ L的dNTPMixture2. 5y1，浓度为5U/y1的Taq酶0? 2y1，浓度为10mmol/L的上游引物 0. 3y1，浓度为10mmol/L的下游引物0. 3y1，模板1y1，H20补足至25y1;
[0021] 扩增程序为：94°C预变性5min;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，35个 循环；72°C延伸10min;
[0022] 所述b步骤具体为：以美国Fermentas公司的RevertAidFirstStrandcDNA SynthesisKit试剂盒的说明书步骤，以巴西橡胶树热研8-79胶乳RNA为模板，合成5'RACE 第一链cDNA，以UPM和5'RACE-GSP为引物，5'RACE第一链cDNA为模板进行PCR，以此PCR 产物100倍稀释液为模板，以NUP和5'RACE-NSP为引物，进行第二轮巢氏PCR扩增，扩增程 序同第一轮；
[0023]所述c步骤具体为：以美国Fermentas公司的RevertAidFirstStrandcDNA SynthesisKit试剂盒的说明书步骤，以巴西橡胶树热研8-79胶乳RNA为模板，合成3'RACE 第一链cDNA，以UPM和3'RACE-GSP为引物，3'RACE第一链cDNA为模板进行PCR，以此PCR 产物100倍稀释液为模板，以NUP和3'RACE-NSP为引物，进行第二轮巢氏PCR扩增，扩增程 序同第一轮。
[0024] 本发明的橡胶树Y谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因，其在制备表达橡胶树y 谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因的表达载体中的应用。进一步优选的方案为所述表达载 体为含有SEQIDNo: 1-0RF序列的重组质粒或含有SEQIDNo: 1-0RF序列的转基因大肠杆 菌；所述SEQIDNo: 1-0RF序列为编码基因开放阅读框的碱基序列。更进一步优选的方案 为所述重组质粒为pET-sumo-SEQIDN〇:1_ORF;其中pET-sumo为载体质粒。
[0025] 其中，所述pET-sumo-SEQIDNo:1-0RF重组质粒通过如下步骤制得：
[0026] 所述pET-sumo-SEQIDNo:1-0RF重组质粒通过如下步骤制得：
[0027] A.pMD18-SEQIDNo:l重组质粒的制备：将SEQIDNo:l所示的核苷酸序列与 PMD18-T载体质粒连接，得到pMD18-SEQIDNo:1重组质粒；
[0028]B.PCR扩增：以步骤A得到的pMD18-SEQIDNo: 1重组质粒为模板，进行PCR扩增， 然后将扩增后的PCR产物与pET-sumo载体质粒连接，即得pET-sumo-SEQIDNo: 1-0RF重 组质粒；
[0029] PCR扩增所用的引物对为：
[0030]上游引物 0RF-F:5,-GACTATGGCGCTTGTTTCTCAGGCAGGC-3，；
[0031] 下游引物 0RF-R:5'-GGCCTTTAGTACAGTAGTTCCTCAAAAAC-3'；
[0032]每20y1 的PCR反应体系为：10yL2XSYBRGreenIMasterMix、上游引物和 下游引物〇? 2yL、100ng模板、H20补足至20yL;
[0033] ?0?反应程序：94°(：预变性5111111;94°(：变性3〇8,60°(：退火3〇8,72°(：延伸1.5111111， 35个循环；72°C延伸10min。
[0034] 本发明中，优选的方案为所述含SEQIDNo:1-0RF序列的转基因大肠杆菌通过如 下步骤制得：将含有SEQIDNo:1-0RF序列的重组质粒导入大场杆菌中，即得。
[0035] 本发明的橡胶树Y谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因，其在提升橡胶树橡胶产 量方法中的应用。
[0036] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明的橡胶树Y谷氨酰半胱氨酸合成 酶的编码基因，可以表达合成Y谷氨酰半胱氨酸合成酶，并通过进行重组质粒、导入大肠 杆菌中，并应用到橡胶树中，促使半胱氨酸合成的速度，进而提升细胞体内外硫醇（GSH)浓