对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物分析技术领域，涉及对乙酰氨基酚注射液的分析方法，具体涉及 对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的测定方法。
【背景技术】
[0002] 对乙酰氨基酚用于发热，也可用于缓解轻中度疼痛，如头痛、肌肉痛、关节痛以及 神经痛、痛经、癌性痛和手术后止痛等。本品可用于对阿司匹林过敏或不能耐受的患者。
[0003] 对乙酰氨基酚注射液的处方中采用盐酸半胱氨酸为抗氧剂，盐酸半胱氨酸的毒性 小，本身不易变色，而且有一定的助溶作用，可以改善溶液的颜色和澄明度，但是盐酸半胱 氨酸极易被氧化，生成氧化降解杂质胱氨酸，上述两种物质在制剂中的含量均需进行控制。 针对这样的需求，研究并开发一种对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸 的测定方法，这显得尤为重要。
[0004] 中国药典2010年版、美国药典（USP35-NF30)及EP8. 0中盐酸半胱氨酸原料含量 测定方法均采用滴定法，但对乙酰氨基酚注射液为注射液，成分较复杂，且作为附加剂的半 胱氨酸含量较低，滴定过程中指示剂加入量、指示终点与等当量间、操作者对颜色判断等， 容易造成较大误差，因此该方法影响对产品的质量控制而不适用。
[0005] 另外，常用的衍生化方法样品配制过程较复杂，且重复性较差。再者，中国药典 2010年版和美国药典（USP35-NF30)有关物质采用薄层色谱法，但该方法灵敏度低，准确度 低，不能对半胱氨酸及其降解产物进行定量测定，仅能作为限度检查。EP8.0中半胱氨酸有 关物质方法采用氨基酸分析仪，该仪器价格较昂贵，专属性强，大部分厂家并不具备。
【发明内容】
[0006] 为了解决对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的分析方法的 问题，本发明人通过大量试验摸索了该制剂的质量控制方法，最终以含离子对的磷酸盐缓 冲液及甲醇为流动相，采用梯度洗脱的方法成功分离盐酸半胱氨酸与杂质，并严格进行方 法验证，保证方法的科学严谨，满足了研发和生产的需求。
[0007] 因此，本发明的目的在于提供一种对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产 物胱氨酸的检测方法，该方法适用于乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及其降解产物胱氨 酸的分离及定量检测。
[0008] 具体地，实现本发明目的的具体技术方案概况如下：
[0009] -种对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法，其采用 高效液相色谱法，按以下流动相条件进行梯度洗脱：流动相A为含离子对的磷酸盐溶液，用 磷酸调节pH = 3. 5-5. 0 ;流动相B为甲醇；按体积比计流动相的梯度设置如下：
[0010] CN 105181859 A 说明书 2/6 页
[0011] 所述的离子对在溶液中的浓度为0. 2~20mmol/L，所述的磷酸盐在溶液中的浓度 为 0·2 ~20mmol/L。
[0012] 优选地，如上所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测 方法，按体积比计流动相的梯度设置如下：
[0013]
[0014] 所述的离子对在溶液中的浓度为2~5mmol/L ;所述的磷酸盐在溶液中的浓度为 1 ~5mmol/L〇
[0015] 优选地，如上所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测 方法，所述的离子对选自如下的一种或两种以上：己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠； 所述的磷酸盐选自磷酸二氢钾或/和磷酸二氢钠。
[0016] 进一步优选地，如上所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸 的检测方法，所述的离子对为己烷磺酸钠；所述的磷酸盐为磷酸二氢钾。
[0017] 再进一步优选地，如上所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨 酸的检测方法，所述高效液相色谱法的色谱柱选用十八烷基硅烷键合硅胶柱或辛烷基硅烷 键合硅胶柱。
[0018] 再进一步优选地，如上所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨 酸的检测方法，所述高效液相色谱法的检测波长为200~230nm。
[0019] 再进一步优选地，如上所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨 酸的检测方法，所述高效液相色谱法的检测波长为205nm。
[0020] 在本发明的一个最优选的实施例中，如上所述对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨 酸及降解产物胱氨酸的检测方法，其中色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；柱温为25°C， 进样量为20 μ 1，流速为1.0 ml/min，检测波长为220nm，按体积比计流动相的梯度设置如 下：
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[0022] 与现有技术相比，本发明方法具有如下有益效果：
[0023] (1)与薄层色谱法比较，本发明的方法可实现对盐酸半胱氨酸的定量测定，能有效 控制盐酸半胱氨酸氧化降解产生的胱氨酸的含量，远远优于药典的薄层色谱法。
[0024] (2)与滴定法相比较，本发明的方法没有因操作及主观判断产生的误差，且能将降 解产物胱氨酸进行定量检测，其它物质对半胱氨酸的干扰也较小，准确度高。
[0025] (3)与采用氨基酸分析仪的方法比较，本发明的方法在普通高效液相色谱仪及紫 外检测器基础上，采用普通的色谱柱，辅之以梯度洗脱方法，灵敏度较高，分离度和准确度 均较佳，且本法较氨基酸分析仪的检测成本低，更加适用于常规的盐酸半胱氨酸及降解产 物胱氨酸的检测。
[0026] 总之，本发明可用于对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸的含量检测以及半胱氨 酸降解产物胱氨酸的含量控制，以及盐酸半胱氨酸原料的含量测定，并且半胱氨酸与胱氨 酸有较好的分离度，专属性强，灵敏度高，操作简便。
【附图说明】：
[0027] 图1 :半胱氨酸定位； 图2 :胱氨酸定位；
[0028] 图3 :样品； 图4 :胱氨酸和半胱氨酸分离度；
[0029] 图5 :半胱氨酸原料酸破坏； 图6 :半胱氨酸原料碱破坏；
[0030] 图7 :半胱氨酸原料氧化破坏； 图8 :半胱氨酸原料高温破坏；
[0031] 图9 :半胱氨酸原料光照破坏； 图10 :样品酸破坏；
[0032] 图11 :样品碱破坏； 图12 :样品氧化破坏；
[0033] 图13 :样品尚温破坏； 图14 :样品光照破坏；
[0034] 图15 :样品检验-1403161批； 图16 :样品检验-1403171批；
[0035] 图17 :样品检验-1403181批。
【具体实施方式】
[0036] 以下通过实施例形式，对本发明涉及的对乙酰氨基酚注射液中盐酸半胱氨酸及降 解产物胱氨酸的检测方法作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围 仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0037] 实施例一、盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的分析方法的开发
[0038] 为控制产品的质量，抗氧剂含量是注射液中比较重要的指标，对于盐酸半胱氨酸 的含量检测已有较多标准及文献的方法，但是对于对乙酰氨基酚注射液中的盐酸半胱氨酸 及其降解产物胱氨酸的检测并不适用，对此，我们展开了注射液中盐酸半胱氨酸及降解产 物胱氨酸的的检测方法的研究和探索。
[0039] 盐酸半胱氨酸的检测方法有滴定法、UV法及HPLC法等，我们采用HPLC法建立本 品中盐酸半胱氨酸及降解产物胱氨酸的检测方法。
[0040] 色谱条件：AgilentllOO系列HPLC仪，试验采用色谱柱为CHR0MASIL C18 (250mmX 4. 6mm，5 μ m)，以磷酸盐缓冲液[取己烷磺酸钠0· 5g，磷酸二氢钾0· 2g，加水 1000 ml溶解，并用磷酸调节pH为4. 0]为流动相A ;甲醇为流动相B，梯度洗脱，流速为每分 钟1.0 ml ;柱温为25°C ;检测波长为205nm ;进样量为20 μ 1。
[0041] 梯度洗脱：甲醇与磷酸缓冲盐溶液的体积比例为：0-10分钟时，2 :98 ;11-20分钟 时，50 :50 ;21-40 分钟时，2 :98。
[0042] 流动相的筛选：对乙酰氨基酚注射液中含有主药对乙酰氨基酚、辅料盐酸半胱氨 酸及其它辅料，流动相的选择主要考虑对乙酰氨基酚及其他辅料与胱氨酸和盐酸半胱氨酸 的分离效果，本发明人采用了各种不同的流动相后的具体试验结果如下：
[0043] 1、采用磷酸盐缓冲液-乙腈为流动相，盐酸半胱氨酸几乎无保留，出峰较早，逐级 降低乙腈比例至〇%，保留时间无明显延迟，且与其它辅料峰及降解产物分离度较小，并不 适用。
[0044] 2、采用磷酸盐缓冲液（含四丁基氢氧化铵）_乙腈（92 :8)，盐酸半胱氨酸几乎无 保留，逐级降低甲醇比例至10 %、5 %、0 %，盐酸半胱氨酸仍出峰较早，保留时间无明显延迟 现象，与其它辅料峰及降解产物分离度较小，并不适用。
[0045] 3、以醋酸铵溶液-甲醇（85 :15)为流动相，盐酸半胱氨酸几乎无保留，逐级降低甲 醇比例至