用于mthfr-a1298c基因位点多态性检测的引物组、其检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于核酸的测定与检验方法技术领域，具体涉及用于MTHFR-A1298C基因 位点多态性检测的引物组、其检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 中国是世界上出生缺陷的高发国家之一，每年的出生缺陷儿数量约占全世界的 20%。叶酸缺乏是导致新生儿出生缺陷的主要原因。导致机体缺乏叶酸有两个方面的原因： 一是叶酸摄入量不足，二是由于遗传(基因）缺陷导致机体对叶酸的利用能力低下（叶酸代 谢通路障碍)。5, 10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR)等基 因变异引起的相应的酶活性降低可阻抑同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸，导致低叶酸血症和 高同型半胱氨酸血症，从而增加新生儿出生缺陷风险或自发性流产等风险。
[0003] 同型半胱氨酸（Hcy)，是人体内一种含硫氨基酸，是蛋氨酸代谢的中间产物。在 Hey代谢过程中，叶酸和亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR)起关键作用，叶酸和MTHFR共同为 Hey代谢提供甲基供体。当体内的叶酸含量不足，或MTHFR基因C677T发生突变时，Hey就 会在体内不断的累积，造成高Hey血症。亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR)是同型半胱氨酸 代谢的关键酶之一，其677位点有三种基因分型，野生型CC，杂合突变型CT，纯合突变型TT。 有研宄发现，MTHFRC677T突变可使酶活性明显下降，使得甲基供体的生成不足，体内的Hey 代谢异常，从而导致Hey浓度的升高。其中，CT型的活性是CC型的65%，而TT型的活性仅 为CC型的30%。亚甲基四氢叶酸还原酶C677T突变是引起高Hey的主要遗传因素。高血压 伴有高同型半胱氨酸（即Hey血浆浓度大于等于10ymol/L)的原发性高血压就是H型高血 压。研宄表明：中国有2亿高血压患者，其中1. 5亿是H型高血压，H型高血压患者占75%，H 型高血压是中国脑卒中高发的主要高危因素，H型高血压患者心脑血管事件是正常人的28 倍。H型高血压患者又合并TT基因突变，心脑血管事件风险增加到40倍。早期发现高Hey 血症从而能够早期纠正高Hey血症、及早防治心脑血管疾病是人们研宄的方向，而对MTHFR C677T多态性检测可做到早期发现、早期纠正高Hey血症，为及早防治心脑血管病提供了一 条新的途径。
[0004] 亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydorfolatereductase，MTHFR)是叶 酸代谢过程中的关键酶，可将还原型叶酸转变为5-甲基四氢叶酸（5-MTHF)，前者是胸苷酸 合成的重要原料之一，参与DNA的合成与修复；后者是体内主要的甲基供体，参与DNA甲基 化。MTHFR对于DNA的合成、活化及修复有着极为重要的调控作用，其功能异常可导致DNA 正常功能不能维持。MTHFR基因在677位点存在C>T改变，导致Ala222Val氨基酸替换， 使酶活性显著降低，使体内5，10-亚甲基四氢叶酸（5，10-MTHF)水平升高、5-甲基四氢 叶酸（5-MTHF)水平随之下降，进而影响叶酸正常代谢，以及甲氨蝶呤、5-FU等药物的疗效 和毒副作用。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX)是叶酸诘抗剂，能抑制亚甲基四氢叶酸还原 酶（methylenetetrahydorfolatereductase，MTHFR)，在急性淋巴细胞白血病（特别在侵 犯中枢神经系统时)、颜内原发性中枢神经系统淋巴瘤（primarycentralnervoussystem lymphoma，PCNSL)、恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌、乳腺癌、盆腔肿瘤、头颈部肿瘤、肺癌及骨 肉瘤等多种肿瘤的化疗中发挥重要作用。但在治疗过程中患者常出现不良反应，包括胃肠 道反应、骨髓移植和肝功能损害等。研宄发现MTHFR基因第677位碱基的C>T突变显著 增加MTX的毒副作用。5-氟尿嘧啶（flu〇r〇uracil，5-FU)为嘧啶类似物，属于抗代谢药 的一种，进入体内后，在胸苷激酶的催化下转变成5-氟-2-脱氧尿苷-5-单磷酸盐，再与 5，10-MTHF及胸苷酸合成酶形成共价络合物，从而干扰DNA的合成和修复。MTHFR能将5， 10-MTHF转变成5-MTHF，从而参与蛋氨酸代谢循环和DNA甲基化。因此，MTHFR的活性将直 接影响体内5，10-MTHF的浓度，进而影响5-FU疗效。研宄结果表明，MTHFR基因第677位 碱基的C>T突变可以导致酶活性显著下降，从而增加对5-FU的敏感性。因此，MTHFR基因 677C/T多态性可用于指导该类药物的个体化使用，以提高临床治疗的针对性和可预见性。 [0005] 综上，检测MTHFR基因的多态性能够用于临床指导5-FU类、甲氨蝶呤等个体化用 药及育龄期妇女叶酸补充，具有重大意义。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了用于MTHFR-A1298C基因位点多态性检测的引物组，本发明还提供 了MTHFR-A1298C基因的位点多态性检测方法，能够用于临床指导5-FU类、甲氨蝶呤等个体 化用药及育龄期妇女叶酸补充，具有重大意义。
[0007] 本发明提供的用于MTHFR-A1298C基因位点多态性检测的引物组由PCR扩增引物 和SNaPshot扩增引物组成，所述PCR扩增引物为： MTHFR-A1298C-Fwd：CAAGGAGGAGCTGCTGAAG(SEQIDNO. 1), MTHFR-A1298C-Rev：CATCACTCACTTTGTGACCATT(SEQIDNO. 2)； 所述SNaPshot扩增引物为： SNE-MTHFR-A1298C：GATGTGGGGGGAGGAGCTGACCAGTGAAG(SEQIDNO. 3)〇
[0008] 本发明还提供MTHFR-A1298C基因的位点多态性检测方法，步骤如下： (1) 采用PCR扩增MTHFR-A1298C基因检测位点所在基因片段并纯化； (2) 采用SNaPshot法对扩增产物进行微测序，分析测序结果； 其中，步骤（1)所述扩增时的引物序列为： MTHFR-A1298C-Fwd：CAAGGAGGAGCTGCTGAAG(SEQIDNO. 1), MTHFR-A1298C-Rev：CATCACTCACTTTGTGACCATT(SEQIDNO. 2)； 步骤（2)所述SNaPshot法中使用的引物序列为： SNE-MTHFR-A1298C：GATGTGGGGGGAGGAGCTGACCAGTGAAG(SEQIDNO. 3)〇
[0009] 优选地，步骤（1)中所述PCR扩增反应体系为：Q5?热启动超保真2XMaster Mix12. 5yL;H20 5. 5yL;引物 5. 0yL，模板DNA2. 0yL;反应条件为：98°C3min; 98°C10s;58°C30s;72°Clmin;29 个循环；72°C5min; 25°C保温；其中，所述引物为 MTHFR-A1298C。
[0010] 优选地，步骤（2 )中所述SNaPshot法微测序中，SNaPshotPCR扩增反应体系 为：SNaPshot预反应混合液 1.25yL;5Xsequencingbuffer1.50yL;ddH20 4.25yL; 2.OyLSNaPshot引物；l.OyL纯化产物；反应条件为：96°C，10s;55°C，5s;60°C，30s;25个 循环；4°C保温；其中，所述SNaPshot引物为SNE-MTHFR1298。
[0011] 本发明采用上述引物和扩增条件能够高效扩增核苷酸序列：MTHFR-A1298C的核 苷酸片段。其中，核苷酸序列中加黑加大的字母为SNP位点。
[0012] 本发明的第三个目的是提供上述引物组在制备检测用于MTHFR基因位点多态性 试剂中的引用。
[0013] 本发明的第四个目的是提供上述引物组在检测MTHFR基因A1298C的多态性中的 应用。
[0014] 本发明的第五个目的是提供上述引物组在分析甲氨蝶呤的毒副作用，分析5-FU 的疗效，早期发现高Hey血症，分析叶酸缺乏原因中的应用。
[0015] 本发明的MTHFR-A1298C基因的多态性检测方法具有高灵敏性、高准确度和高精 密性的优点，是一种便捷可靠的MTHFR-A1298C基因位点多态性检测；结果直观且实验稳定 性好。应用本发明的检测方法能够有效指导临床5-FU类个性化用药，能够做到早期发现、 早期纠正高Hey血症；同时，为育龄期妇女补充叶酸提供基因依据。
【附图说明】
[0016] 附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1为本发明MTHFRA1298C:A/A的基因扩增产物的部分测序图； 图2为本发明SNaPshot法检测MTHFR_A1298C基因多态性的检测结果图。
【具体实施方式】
[0017] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市 售。
[0018] 本申请所用仪器参见表1。
[0019] 表1本申请实验所用仪器
本申请所用试剂如下： Q5?热启动超保真2XMasterMix，购自NEB公司，货号：M0494L，-20°C。
[0020] 实施例1 一.采用PCR法扩增检测位点所在基因片段 1待测样本DNA提取 本检测采用QIAampDNAMiniKit试剂盒提取外周血DNA，提取步骤参考试剂盒说明 书。
[0021] 试剂准备 a、 本申请中引物序列为本申请人自行设计，具体序列参见表2，Invitrogen公司生产， 使用浓度为5.Opmol/yL;干粉于-20°C保存，有效期一年；工作液于4°C保存，有效期半年； 基因参考序列号为 HTHFR：NG_013351. lj KH_005957. 4 SNP位点参考NCBI和UCSC数据库。
[0022] 表2PCR扩增时所用引物序列
b、 取出Q5?热启动超保真2XMasterMix，primers，ddH20,室温融化后，短暂离心；配 制引物：MTHFRA1298C，震荡混匀；短暂离心后备用； 反应体系配制： Q5?热启动超保真 2XMasterMix 12. 5yL H20 5. 5uL 共计 18uL。
[0023] 震荡混匀，短暂离心后，分装18. 0yL至标记好的PCR反应管；在PCR反应管中加 入引物5. 0yL后转移至标本制备区。本检测使用高保真热启动聚合酶，因此，在工作过程 中可预先配制好18. 0yL的反应体系并保存于-20°C，每次使用时取出，加入5. 0yL引物即 可用于检测，也可将引物直接与聚合酶混合，保存于-20°C备用。
[0024] 加样扩增 向分装好的PCR反应管中加入2.0yL稀释后的模板；进行PCR扩增，扩增条件如下： 98°C3min;98°C10s;58°C30s;72°Clmin;29 个循环；72°C5min; 25°C保温。得到核 苷酸序列。采用上述引物和扩增条件能够高效扩增核苷酸序列：MTHFR-A1298C的核苷酸片 段。其中，核苷酸序列中加黑加大的字母为SNP位点。
4对扩增产物进行微测序 DNA模板在DNA聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在反应 系统中分别按比例引入四种带有荧光标记的双脱氧碱基（ddNTP)，只要双脱氧碱基掺入链 端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。如此每管反应体系中便合成 以共同引物为5'端，以双脱氧碱基为3'端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，进 行毛细管电泳，以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3'端的 双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
[0026] 荧光标记单碱基延伸技术（SNaPshot，SNE)是美国应用生物公司（ABI)开发，是一 种基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称微测序，是指在一个含有