一种浴场海水中致病性细菌的基因芯片检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境检测技术领域，涉及一种浴场海水中致病性细菌的基因芯片检测 方法。
【背景技术】
[0002] 夏秋时节旅游旺季海滨浴场承受着超负荷的压力，给浴场水质带来了严重的影 响，同时也增加了病原微生物的传播机会。细菌是引发感染性疾病的主要病原体，在抗生素 滥用的选择压力下，海洋环境中出现了大量的耐药细菌，给人类健康带来了潜在且无法估 计的新威胁，因此，多种致病性细菌的同时、快速、灵敏、特异的诊断是有效预防感染性疾病 发生，控制其暴发性传播的前提和关键。虽然PCR及其衍生技术能够实现致病性细菌的快 速、灵敏诊断，但是一次只能同时检测一种致病性细菌，与之相比，基因芯片技术具有高通 量、平行性、微型化、自动化等显著优点，该技术的出现为致病性细菌的分子诊断提供了有 力的技术支撑。
[0003]目前国内外许多学者都已经将基因芯片技术应用到临床以及食品安全等多个研 宄领域。我国自1997年开始了解生物芯片技术，1998年正式进入芯片研宄，现全国已有20 多家科研机构和公司从事生物芯片的研发。目前与致病性细菌检测相关的基因芯片研宄获 得长足进展，已申请的专利包括"食源性致病菌快速检测基因芯片及其应用"、"炭疽菌诊断 基因芯片的制备及应用"、"泌尿生殖道炎症病原体和耐药性集成诊断基因芯片及方法"等 上百种。然而由于海水中杂质较多、致病性细菌种类繁多，且检测靶位易突变，给该方法的 应用带来一系列困难，造成该方法尚未在海洋环境检测领域得以应用。
[0004] 目前，基因芯片对应的探针靶定区域通常选择致病性细菌的16SrDNA序列、23S rRNA序列和16SrRNA-23SrRNA基因。16SrDNA序列因具有高度保守性，已成为细菌种属鉴 定最常用的序列，但由于其高度保守性，因而不能很好的鉴别相近种或同一种内的不同菌 株；而23SrRNA序列目前被报道的比较少，我们常常无法获取需要的序列；16SrRNA-23Sr RNA基因区间由于其可用于鉴别相近种，或同一种内的差异，而被广泛应用，但对于只有一 个或两个操纵子拷贝的细菌而言，不能利用16SrRNA-23SrRNA的基因区间序列进行探针 的设计，因此，为保证其特异性，需要选择合适的特异性的靶基因进行引物设计。
[0005]目前基因芯片对应的探针种类主要有两种，一种是进行氨基修饰的长度在 20-40mer的探针，另一种是不进行氨基修饰的60-70mer的探针。以往的研宄多采用的是短 探针。短探针可用来检测单个碱基的不同，提高检测的特异性，需点制在醛基基片上；而长 探针不需要检测到单个碱基的差异，当考虑到不同个体之间的核酸碱基多态性时，可选择 设计此类探针，该类探针需点制在氨基基片上。与短探针相比，长探针具有更好的特异性和 均一的退火温度（Tm值），被证明在灵敏度和特异度两方面表现更佳，此外还能兼顾信号强 度，但是以往的研宄多采用短探针。
【发明内容】
[0006] 本发明以浴场海水中对人类危害较大的6种致病性细菌为研宄对象，旨在建立浴 场海水致病性细菌的基因芯片检测方法，科学合理的确定其反应条件的最优化，并克服海 水环境复杂的缺点，保证检测的特异性。建立其基因芯片的检测方法。本发明所采用的技 术方案是：
[0007] -种浴场海水中致病性细菌的基因芯片检测方法，该检测方法的步骤为：
[0008] 第一步：致病性细菌及其靶基因的确定。根据国内外大量的文献报道以及本研宄 前期大量的调查研宄为基础，确立了浴场海水中常见的、对人类危害较大的6种致病性细 菌，分别为嗜水气单胞菌、大肠杆菌〇157:H7、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌、溶藻弧菌、金黄 色葡萄球菌。
[0009] 根据国内外文献确定上述各菌株的特异性靶基因。其特异性靶基因分别为： 嗜水气单胞菌（A.hydrophila)的Ahal基因、大肠杆菌0157 :H7 (E.coli0157:H7)的 hlyA、fliC、rfbE基因、肠炎沙门氏菌（Salmonella)的invA和hilA基因、单增李斯特菌 (L.monocytogenes)的pic和hlyA基因、溶藻弧菌（V.alginolyticus)的hsp60 基因、金黄 色葡萄球菌（S.aureus)的tuf基因。
[0010] 第二步：6种浴场致病性细菌70-mer寡核苷酸探针及引物的设计。应用AllelelD 6. 0软件设计特异基因的引物及寡核苷酸探针，并应用DNASTAR软件对其进行评价。引物和 探针信息如表1和表2所示。
[0011] 表1各致病性细菌的引物序列及其Tm值
[0013]
[0014] 表2各致病性细菌的探针序列及其Tm值
[0017] 第三步：焚光标记PCR产物。PCR扩增采用20yL反应体系，
[0018] 1〇xPCR缓冲液(AMgCI2) 2.0(jL dNTPs(10mmol/L) 0.4|jL 上下游引物(10pmol/pL) ^ 0.5 |jL TaqDNA聚合酶（5U/mL) 0.2mL DNA模板 1|JL ddH20 15.4 mL
[0019] 1)取5 y L PCR产物至无菌洁净的0. 2mL离心管中，作为模板；
[0020] 2)向每个样品管加入一定浓度的带有荧光素Cy3标记的随机引物（9N)溶液 3yL，并补水至19yL，震荡混匀，瞬时离心。在最佳探针浓度和最佳基因组浓度条件下， 进行Cy3-随机引物浓度的确定，当Cy3-随机引物浓度为0. 375yM时，能产生肉眼可见的 荧光。而当Cy3-随机引物浓度为0. 190yM时，荧光度值< 1000,产生的荧光极弱，说明 Cy3-随机引物的最低浓度至少可达到0. 375yM，为确保能产生稳定的荧光信号，本实验过 程中采用的Cy3-随机引物浓度为0. 75yM;
[0021] 3)将离心后的样品管放入PCR仪，95°C变性3min，立即放置冰上3min;
[0022] 4)在冰上制备焚光标记反应体系Mix:5XKlenowBuffer2. 5uL，klenow酶 1yL,dNTP(2. 5mM)2. 5yL；
[0023] 5)将步骤3)样品管瞬时离心，并向各管中加入6yL荧光标记反应体系Mix，震荡 混匀，瞬时离心；
[0024] 6)将离心管放入PCR仪，进行荧光标记扩增，荧光标记反应程序为：37°C1.5h， 70°C10min〇
[0025] 7)程序结束后，将样品置于冰上，然后进行芯片杂交。为确定最佳的紫外交联时 间，在紫外照射能量为2400mJ条件下，分别照射0. 5h、lh、2h、3h、4h、5h、6h，紫外交联lh时， 即可产生肉眼可见的荧光信号，荧光信号值为5808,而交联0.5h时，荧光值为< 1000。因 此确定当紫外照射能量为2400mJ时，最低紫外交联时间为lh，为确保实验的能产生稳定荧 光信号，本实验采用的紫外交联时间为2h;
[0026] 第四步：制备基因芯片。采用喷点式芯片点样系统点样仪，以及Nano-tip A070-401点样针进行点样。将一定浓度的探针与点样液等体积混合，然后用移液枪将其混 合物加入384孔板，按照设定好的参数将探针点到氨基化玻片上，每个点重复三次。点样 时要注意保持湿度为70%，点样时除放芯片之外，还要放一张感应试纸（用于观察点样效 果）。点样完毕后，将点好的芯片取出，关闭仪器。将点制好的芯片放入紫外灯下交联一定 的时间，然后用0.5%的SDS冲洗2min，用离心机甩干后，放入4°C冰箱避光保存备用。通 过设置探针浓度梯度，发现探针浓度为1UM到16yM都可以检测到荧光信号，而探针浓度 为0. 5yM时，荧光度值< 500,荧光信号很微弱，因此我们确定探针的最小终浓度为1yM， 为确保实验的经济合理且顺利进行，实验过程中我们采用能产生较强稳定荧光信号的探针 浓度2yM;
[0027] 第五步：杂交。将杂交buffer放到50°C水浴锅中预热，然后配置20yL的杂交液：
[0028] 4X杂交缓冲液 5yL
[0029] 焚光标记产物15 yL
[0030] 杂交液配好后，95°C变性3min，立即放置冰上，然后放入沸水中煮沸2min后，立即 放入预冷的无水乙醇中lmin，用低速离心机将芯片甩干。然后将该芯片对应的感应试纸放 于芯片下面，按照感应试纸上矩阵的排列方式。避光条件下，用移液枪取15yL的荧光标记 产物和5yL的阳控混合均匀后加入芯片点样区，然后盖上盖玻片，然后将此芯片放入65°C 水浴锅中水浴2h或过夜；
[0031] 第六步：芯片清洗及扫描。取出上一步的芯片，用自来水冲洗半分钟，再用蒸馏 水冲洗一次，然后分别用42°C预热过的洗液I、II、III分别洗脱2min，洗液I是用10mL20XSSC(175. 3g氯化钠，88. 2g柠檬酸钠，加蒸馏水定容至1000mL，pH为7. 0)和4mL 10XSDS(10g二十烷基磺酸钠加入双蒸水100mL制成）加入186mL蒸馏水混匀制成；洗液 II是用2mL20XSSC加入198mL蒸馏水混匀制成；洗液III是用lmL20XSSC加入199mL蒸 馏水混匀制成，然后将芯片离心甩干。用生物芯片扫描仪扫描芯片，并输出荧光值，然后用 软件分析所得数据。
[0032] 本发明的探针分别根据嗜水气单胞菌的Ahal基因、大肠杆菌0157 :H7的hlyA、 fliC、rfbE基因、肠炎沙门氏菌的invA、hilA基因、单增李斯特菌的plc、hlyA基因、溶藻弧 菌的hsp60基因和金黄色葡萄球菌tuf基因而设计的特异性的探针，每种致病性细菌设计 了 1-3条探针，其长度约为70-mer。
[0033] 鉴于现有探针技术存在的问题，在探针设计时采取了两种措施：一、为保证物种的 特异性，每