检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的引物、试剂盒及其pcr方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学基因检测领域，特别提供了一种检测CYP2C9和VK0RC1 基因多态性的引物、试剂盒及其PCR方法，用于CYP2C9基因rsl057910和VK0RC1基因 rs9923231多态位点的快速检测。
【背景技术】
[0002] 华法林是目前国内外最常用的长效香豆素类口服抗凝药，也是目前唯一在临床上 使用的维生素K拮抗剂，用于预防和治疗血栓栓塞性疾病以及心脏人工瓣膜置换术和人工 血管移植术等术后抗凝治疗，作为重要的口服抗凝药已经在临床使用接近60年。但华法林 的有效治疗范围较窄且不同个体之间给药剂量存在较大的差异，除了受患者年龄、性别、体 重、体表面积、营养状态、肝肾功能、饮食及使用药物等临床因素的影响外，华法林的代谢酶 CYP2C9*3(1075A-C，rsl057910)和作用靶点VK0RC1(-1639G-A，rs9923231)的遗传多 态性是主要的影响因素，而当前确定华法林需求剂量时无法考虑遗传因素的影响，常常造 成患者严重的出血并发症。
[0003] 华法林在体内的用药剂量主要是经肝脏CYP2C9调整，该酶是肝脏中一种重要的 药物用药剂量酶，大约10%的临床常用药物由CYP2C9代谢，CYP2C9基因上存在多个遗传多 态性位点，国外的研宄表明CYP2C9 *2、*3突变与华法林药效相关，但*2突变在中国人群 中基本不存在，所以本研宄主要针对*3突变进行，即rsl057910位点的A>C多态性。该 位点突变后的酶活性仅为野生型的5%，这种突变降低了酶活性使其底物的清除率降低，血 药浓度升高，携带CYP2C9突变基因的个体在使用华法林的初期就有较高的出血危险性，因 此，需降低临床用药剂量，防止不良反应的发生。CYP2C9基因rsl057910位点多态性的人群 分布频率约是AA(93 %)、AC(6 %)、CC(1%)。
[0004] 华法林是维生素K环氧化物还原酶（VK0R)的特异性抑制剂，VK0R主要由维生素K 环氧化物还原酶复合体亚单位1(VK0RC1)基因编码，该基因上的多个多态性位点与华法林 维持剂量存在相关性，VK0RC1 1639GA、VK0RC1 1173CT、VK0RC1 3730AG基因型两两间存在 连锁不平衡，其中VK0RC11639G-A(rs9923231位点）多态性是影响华法林需求剂量中种 族差异和个体差异的最主要因素，G基因的VK0RC1启动子活性比A基因的启动子活性高出 44%，这会引起￥1((?(：111^隱表达增加，￥1((?生成也相应增多，使有活性的氢醌型维生素1( 生成和凝血因子生成增加，因此需要较高剂量的华法林才能达到抗凝效果。
[0005] 通过对CYP2C9和VK0RC1基因检测，能够快速确定华法林剂量范围，保证疗效，减 少出血风险。把华法林的基因检测结果和INR监控相结合，可以更有效、迅速地调整华法林 维持剂量，从而在达到疗效的同时减少华法林的出血风险。
[0006] 目前对基因突变和基因多态性的检测，常见有直接测序法；基因芯片杂交法； PCR-RFLP方法；PCR扩增产物毛细管电泳分析法；PCR-SSCP ;PCR高分辨熔解曲线分析技 术；PCR-Taqman MGB (Minor Groove Binder)探针法；AS-PCR 法；Cast-PCR 法等。这些方 法或多或少还存在仪器价格高，操作难度大，存在一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床 普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等缺点。
[0007] 如：1)直接测序法是突变分析的金标准，能发现已知和未知突变位点，但该法检测 基因突变的灵敏度为20%(即目的基因的突变基因DNA模板数占野生型DNA模板数的20%)。 同时还存在操作复杂，周期长，分析速度慢，常需要2天的时间，而且该法是开管操作，大大 增加污染的可能性，不适合对大规模标本的检测，同时还需要昂贵的仪器，存在在基层不易 实施等缺点。
[0008] 2)普通PCR-RFLP方法技术简便，价格便宜，适宜少量样本的实验室检测，但RFLP 仅能检测有酶切位点的突变，无酶切位点不能检测，费时费力，还存在PCR产物污染导致 假阳性的风险，见[MolDiagnTher. 2010Jun1; 14(3): 163-9，UnitedStatesPatent 20120135406]。
[0009] 3)芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用 于全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。
[0010] 4)PCR高分辨熔解曲线分析技术，能高通量检测基因的突变情况，试剂成本较低， 但因其荧光信号来自染料，特异性受到影响，而且检测仪器是升级版的荧光PCR仪，价格高 昂，普及受限，见[ClinChimACqa. 2012Nov12;413(21-22):1781-5;UnitedStates Patent20110045479]〇
[0011] 5)PCR_TaqmanMGB探针法适合已知突变位点，常常需要两条探针，而Taqman MGB探针的合成价格是普通Taqman探针的几倍，见[JClinMicrobiol. 2010 Aug;48(8):2909-15;UnitedStatesPatent20090311679]，并且不能检测样本中的含量 较少（彡1，〇〇〇个中的1个）的等位基因或突变位点。
[0012] 6)PCR-SSCP法虽然简单，但该法是开放性的检测系统，容易造成PCR产物的污染， 而且操作步骤多，费时费力。
[0013] 7)等位基因特异性引物PCR扩增法（AS-PCR)，这一方法是目前检测基因突变或 SNP最简单快速的方法（WuDY,UgozzoliL,PalBK,WallaceRB.，ProcNatlAcad SciUSA1989; 86:2757-2760)，其原理是引物3'末端碱基与模板的碱基错配，其PCR的 效率将会下降 1〇3-1〇6.6倍（Chen,X.，andSullivan,PF,ThePharmacogeonomics Journal2003，3，77-96)。尽管该方法的原理简单，但错配的引物，依然会发生非特异 性扩增，扩增情况视突变的类型和检测位点周围的碱基序列相关（AyyadevaraS,Thaden JJ,ShmooklerReisRJ.,AnalBiochem2000; 284:11-18)，还与样本中存在的等位 基因变量的影响。为了增加AS-PCR的特异性，许多科学家做了很多努力。大量的实验证 明，该方法最关键的是设计与3'末端突变位点碱基互补或错配的两条特异引物，引物设 计不好，将导致高背景的交叉扩增，会导致较高的假阳性。尽管不少人努力将这一弊端克 月艮，如报道的TaqMAMA方法，在3'倒数第二位或第三位上引入突变碱基，的确可以增加 反应的特异性，但仍然无法完全消除假阳性，而且在纯合子与杂合子的判断上，缺乏标准， 会出现混乱的情况，见[JVirolMethods. 2008Nov;153(2):156-62;Genomics. 2004 Feb;83 (2) :311-20]。简单的AS-PCR，通常采用PCR反应结束后再进行电泳，从有无反应 条带来判断结果，这种方法虽然不需要昂贵的仪器，但电泳操作，增加了PCR的污染机会， 而且耗时费力。尽管有人对该方法作了改进，采用荧光定量PCR技术，但得到的不是"全或 无"式的结果，总会有非特异性反应的发生，即同样的引物对野生型和突变型位点都会扩 增，只是其得到的ct (Cycle threshold)不同而已，因此就引入了 Act的概念，即ACt= 野生Ct-突变Ct，但计算复杂，如要ACt值大于纯合子Ct值判为突变型纯合子，ACt值 小于杂合子Ct值，判为杂合子，ACt值的引入不仅增加了操作步骤，还会引起混乱，因为 ACt值的设定标准无法准确定位，不同人员的操作、不同的标本和不同的检测仪器都会有 不同的数字，给临床应用带来很大的困难，实际应用依然受限，见[中国专利CN101235415， CN101565742A]〇
[0014] 8)美国LIFE公司采用一种MGB封闭探针的方法，称作Cast-PCR(Competitive allelespecificTaqmanPCR)，用MGB探针将不检测的位点封闭，然后用等位基因特异 引物荧光定量PCR的方法检测目的位点，这虽然提高了检测的特异性，但由于多加入一 条MGB封闭探针，势必增加成本，对反应效率多少会带来干扰，见[ExpMolPathol. 2012 Jun; 92 (3): 275-80;UnitedStatesPatent20100221717 ;CN102428190A]。有人采用锁 核酸（LNA) (PlantMethod2007, 3 :2)或修饰的碱基（AnalBiochem. 2005, 340 :287-294) 的PCR引物，可以使得AS-PCR检测灵敏度提高。然而，这些方法增加了分析的总体成本，并 需对反应进行深度优化。
[0015] 目前，国内已上市有注册证的CYP2C9和VK0RC1基因检测试剂盒有以下四种：人类 CYP2C9和VK0RC1基因检测试剂盒（PCR-荧光探针法）（国械注准20153400247武汉友芝 友医疗科技有限公司）；VK0RC1和CYP2C9基因检测试剂盒（PCR-电化学基因芯片法）（国 械注准20143402241中山大学达安基因股份有限公司）；CYP2C9和VK0RC1基因多态性检 测试剂盒（PCR-芯片杂交法）（国食药监械（准）字2012第3401328号上海百傲科技有 限公司）；CYP2D6*10、CYP2C9 和VK0RC1*3、ADRB1(1165G>C)、AGTR1(1166A>C)、ACE(I/D)检 测试剂盒（基因芯片法）（国食药监械（准）字2012第3401324号湖南宏灏基因生物科 技有限公司）。
[0016] 国内CYP2C9和VK0RC1基因检测的专利多采用液相芯片、普通PCR的方法，例 如李艳，童永清申请的一种用于检测VK0RC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒(专利号CN 102329885A)，采用的是普通的PCR法，后期需要跑胶；广州益善生物技术有限公司申请的 一种CYP2C9基因SNP检测特异性引物和液相芯片（专利号CN101824466A)，采用液相芯片 法对CYP2C9进行基因分型；苏州大学苏州旷远生物分子技术有限公司申请的一种用于华 法林个体化用药相关基因SNP位点检测的试剂盒及其PCR扩增方法(专利号CN101899519 A)，采用的是引物修饰的PCR法，后期需要跑胶；汪道文申请的指导华法林使用起始剂量快 速基因分型的方法和试剂盒(专利号CN102605076A)，采用的是PCR法，但使用了荧光染 料；爱科来株式会社申请的基因扩增用引物对、含有其的基因扩增用试剂及其用途(专利号 CN101568646A)，采用的是探针杂交PCR，但结果判读较为复杂；北京普利耐特生物科技有 限公司中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研宄所申请的一种人细胞色素酶 P450基因多态性检测试剂盒(专利号CN103509858A)，采用的是基因芯片技术。
[0017] 芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化等特点，适用于 全基因组突变扫描，不适宜单个基因的突变位点检测，且精度低，价格昂贵。而普通的荧光 定量PCR技术对最为关键的位点特异性引物设计，也仅按照引物设计的一般原则进行，没 有一个好特异引物的筛选客观指标，最为关键的是他们的结果判断，依然模糊，没有"全或 无"的概念，这样非特异性的缺点还是无法克服。
[0018] 因此，如何对CYP2C9和VK0RC1基因的多态性进行简单准确的检测，成为人们亟待 解决的问题。
【发明内容】
[0019] 鉴于此，本发明提供了一种检测CYP2C9和VK0RC1基因多态性的引物、试剂盒及其 PCR方法，以至少解决以往试剂盒存在的结果判读复杂、检测仪器价格高，操作难度大，存在 一定假阴性和假阳性，检测成本高，临床普及程度低，不能同时大规模检测临床标本等一个 或多个问题。
[0020] 本发明提供的方案具体为：一种检测CYP2C9和VK0RC1基因多态性的引物，其特征 在于，所述引物包括：检测CYP2C9基因野生型特异性上游引物、检测CYP2C9基因突变型特 异性上游引物和检测CYP2C9基因野生型特异性上游引物与检测CYP2C9基因突变型特异性 上游引物共用的第一下游引物； 且所述检测CYP2C9基因野生型特异性上游引物具有SEQ No. 17序列，所述检测CYP2C9基因突变型特异性上游引物具有SEQ No. 14序列，所述第一下游引物具有SEQ No. 16序列； 检测VK0RC1基因野生型特异性上游引物、检测VK0RC1基因突变型特异性上游引物和 检测VK0RC1基因野生型特异性上游引物与检测VK0RC1基因突变型特异性上游引物共用的 第二下游引物； 且所述检测VK0RC1基因野生型特异性上游引物具有SEQ No. 38序列，所述检测VK0RC1基因突变型特异性上游引物具有SEQ No. 35序列，所述第二下游引物具有SEQ No. 37序列。
[0021] 本发明一方面还提供了一种检测CYP2C9和VK0RC1基因多态性的试剂，其特征在 于：所述试剂含有上述的引物。
[0022] 本发明另一方面还提供了一种检测CYP2C9和VK0RC1基因多态性的试剂盒，其特 征在于：所述试剂盒也含有上述的引物。
[0023] 优选，所述试剂盒还包括分别与检测CYP2C9和V