同时检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的引物与方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，尤其设及一种同时检测VK0RC1和CYP2C9基因多 态性的引物与方法。
【背景技术】
[0002] 目前已发现的CYP2C9等位基因有30种，其中W CYP2C9*1(野生型）、 CYP2C9*2k.430OT，Argl44Cys，rsl799853)、CYP2C9*3(C.1075A〉C，Ile359Leu， rsl057910)最为常见。
[0003] CYP2C9*2和CYP2C9*3基因频率在不同人种和不同民族之间差异较大，在中国人 群中的等位基因频率远远低于白种人。研究表明，CYP2C9基因突变状态与华法林类药物临 床用药敏感性及毒性关系密切，携带有变异性等位基因的患者，其华法林代谢酶的活性明 显低于野生型，并且其出血的危险性增加2-3倍，CYP2C9*l/*3和CYP2C9*3/*3患者与野生 型患者相比，华法林用药分别要减少33. 7%和78. 1%。
[0004] 维生素K环氧化物还原酶（VK0R)能够促进一系列级联反应引起血液凝固。VK0R主 要由VK0RC1基因编码，其活性与VK0RC1多态性位点关系密切。VK0RC1启动子区域-1639 位G〉A变异导致其启动子活性不同。VK0RC1GG和AG基因型与AA基因型相比，GG和AG基 因型由于其启动子活性高，VK0RC1mRNA表达增加，VK0RC1蛋白也相应增加，引起VK0RC1活 性增高，从而凝血因子生成较多。
[0005] 中国专利申请201310533548. 8公开了一种用于CYP2C9和VK0RC1基因巧片检测 的特异性引物对和探针，但基因巧片的设计成本高，检测费用昂贵。现有技术缺少一种特异 性好、灵敏度高、可实现多个位点同时检测的CYP2C9和VK0RC1基因多态性检测引物及其方 法。
【发明内容】
[0006] 为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种同时检测VK0RC1和CYP2C9基因 多态性的引物与方法，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，实现了VK0RC1、CYP2C9*2 和CYP2C9*3基因多态性的同时检测。本发明同时检测的位点包括VK0RC1 (-1639G〉A， rs9923231)、CYP2C如2(430C〉T，Argl44Cys，rsl799853) W及CYP2C9*3 (1075A〉C， Ile359Leu，rsl057910)。
[0007] 本发明提供一种同时检测VKORCl和CYP2C9基因多态性的引物，包括PCR 扩增引物和SNaPshotPCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对VKR0C1-1639G〉A 的上游引物 5' -GCCAGCAGGAGAGGGAAATA-3'（SEQIDNO. 1)和下游引物 5'-AGTTTGGACTACAGGTGCCT-3'（SEQIDNO. 2)，针对CYP2C9*2 的上游引物 5'-CAGCAATGGAAAGAAATGGAAGG-3'（沈QIDNO. 3)和下游引物5'-CAGTAAGGTCAGTGATATGGAGTAG -3'（SEQIDNO. 4)W及针对CYP2C9*3 的上游引物 5'-CAGGAAGAGATTGAACGTGT GAT-3'（SEQIDNO. 5)和下游引物 5'-TAATGTCACAGGTCACTGCATGG-3'（SEQID NO. 6);所述SNaPshotPCR引物包括；针对VKR0C1-1639G〉A的SNaPshotPCR引物 5，-ATAGGCGTGAGCCACCGCACC-3'（SEQIDNO. 7)，针对CYP2C9*2 的SNaPshotPCR引物 5'-TT TTTTTTTGGAAGAGGAGCATTGAGGAC-3,（SEQIDNO. 8)W及针对CYP2C9*3 的SNaPshotPCR引 物 5, -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAA-3' (SEQIDNO. 9) 〇
[000引采用上述技术方案，本发明提供的同时检测VKORCl和CYP2C9基因多态性的引物， 可W实现VK0RC1和CYP2C9基因多态性的特异性检测，不会发生交叉反应，准确性好。
[0009] 优选地，所述PCR扩增引物中，VKR0C1-1639G〉A、CYP2C9*2和CYP2C9*3的引物浓 度比为 1 ;1 ;1 ;所述SNaPshotPCR引物中，VKR0C1-1639G〉A、CYP2C9*2 和CYP2C9*3 的引物 浓度比为1 ;1 ;1。
[0010] 相应地，本发明还提供一种同时检测VK0RC1和CYP2C9基因多态性的方法，包括如 下步骤;A)提取DNA样品巧)采用权利要求1或2中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增， 对扩增产物进行纯化；C)采用权利要求1或2中所述的SNaPshotPCR引物进行SNaPshot PCR扩增，对扩增产物进行纯化；D)毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定 SNP位点及其基因型。
[0011] 优选地，所述步骤A)中的DNA样品为邸TA抗凝外周血的DNA样品。
[001引优选地，述步骤B)中的多重PCR扩增反应条件包括；Step1: 98°C化r3min;Step2: 98°Cfor10s;Step3: 58°Cfor30s;Step4: 72°Cforlmin;Step5:Goto step2,29times；Step6: 72°Cfor5min；Step7: 25°Cforever。
[0013] 优选地，所述步骤C)中的SNaPshotPCR扩增反应条件包括；Step1: 96°C化r 10s;St巧 2: 55°Cfor日s;St巧 3: 60°Cfor30s;St巧 4:Gotost巧 1,25times; Step5: 4°Cforever。
[0014] 优选地，所述步骤D)中，采用GE肥MAP阳RIDV4. 1软件对检测结果进行分析。
[0015] 此外，本发明还提供同时检测VK0RC1和CYP2C9基因多态性的引物在制备检测 VK0RC1和CYP2C9基因多态性试剂中的用途。
[0016] 与现有技术相比，本发明的有益效果是；本发明提供了 一种同时检测VK0RC1 和CYP2C9基因多态性的引物，该引物的特异性好，不会发生交叉反应，准确性好，实现了 VK0RC1、CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性的同时检测，提高了检测效率。此外，本发明还 提供了一种同时检测VK0RC1和CYP2C9基因多态性的SNaPshot法，通过使用特异性的PCR 扩增引物和SNaPshotPCR引物，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，可W为华法林 的临床用药提供指导。
【附图说明】
[0017] 图1本发明提供的VK0RC1和CYP2C9基因引物的扩增片段。
[0018] 图2VK0RC1和CYP2C9基因引物扩增产物的部分测序图。
[0019] 图3样品的VK0RC1和CYP2C9基因多态性检测结果图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
[00川实施例一引物 发明人针对VK0RC1和CYP2C9的基因多态性位点，设计了大量引物，通过 引物反应条件的优化和比较，筛选出了特异性好、不会发生交叉反应且PCR反 应条件非常接近的引物。本发明提供的引物如表1所示，包括PCR扩增引物 和SNaPshotPCR引物，PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物是相对应的。针对 ￥邸0(：1-16396〉4，上游引物为5'-60：46〔46646466644414-3'669 10側.1)，下 游引物为5'-461'17664押4〔466160：1'-3'669 10側.2)，8化口31101?0?引物为 5'-ATAGGCGTGAGCCACCGCACC-3'（SEQIDNO. 7)。本发明提供的所有引物序列均通过UCSC 数据库比对，无已知SNP位点。
[0022]
实施例二引物的特异性 将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting,结果如下；WWa-1639G〉A扩增片段位于chrl6: 31107523-31107812，长度为290bp;073(讲2扩增片段 位于chrl0:96701959-96702133间，长度为17化9;073(讲3扩增片段位于 C虹10:96740948-96741101，长度为154bp;结果如图1所示，所有引物的扩增片段均覆盖了 相应的检测位点：化0化7 -1639G〉A、CW义讲2及CW义讲3,无其它同源基因。
[0023] 使用表1中PCR扩增引物分别对检测样品进行扩增及Sanger测序，测序结果显 示，各引物扩增片段与VKORCl及CYP2C9基因参考序列吻合，结果如图2所示。使用表1中SNaPshotPCR引物，SNaPshot法进行检测，结果如图3所示。从图3可知，各产物峰的相对 位置及测序反应渗入的碱基与预期相符，且无其它干扰峰。
[0024] 实施例二VK0RC巧日CYP2C9基因多态性的检测 提取邸TA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANampBloodDNAKit(购自Tiagen，货号DP318)的说明书，将DM样品稀释至l(K)ng/yL，备用。
[00巧]配制PCR扩增引物混合物，VKR0Cl-1639G〉A、O73C^2和CW义讲3的引物浓度比 为1 ;1 ;1，VKR0C1-1