基于多信号放大技术的双电极传感器检测急早幼粒PML/RARα基因序列的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种基于多信号放大技术的双金电极集成式电化学DNA传感器同时 检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融合基因双链DNA的新型电化学传感检测方法，属 于生物传感技术领域。
【背景技术】
[0002] 急性早幼粒细胞白血病（APL)是急性髓细胞白血病（AML)FAB分型中的Ms亚型，是 严重危害人类健康的恶性血液病之一。它起病急，迅速恶化，表现十分凶险，出血倾向明显， 易发生弥漫性血管内凝血，死亡率高，治疗比较困难。白血病早期诊断（基因诊断）水平将 直接影响患者的治疗效果及生存质量，其重要意义不言而喻。
[0003] 目前临床上常用的检测方法主要有流式细胞技术、FI甜技术、染色体分析法、 RT-PCR技术等，但都存在一定的局限性，如价格昂贵、操作繁琐、灵敏度不高等。因此，研发 一种高敏感性、高选择性的APL相关基因的检测技术具有极其广阔的临床应用前景。
[0004] APL最为常见的染色体易位为t (15 ;17) (q22 ;q21)，其易位产物PML/RARa融合 基因发生于95%的APL中，是恶性克隆的标志基因。
[0005] 临床样品中，待测DNA通常W双链大片段形式存在，双链片段中与祀标ssDNA互补 的另一条DNA序列容易对DM探针分子的检测造成干扰。利用单通道电化学DNA生物传感 器检测基因序列，其单探针捕获祀标dsDNA的过程存在干扰分子识别及降低杂交效率等不 足。因此，为解决传统电化学DNA生物传感器的局限性，对原有单组DNA探针分子进行优 化，对工作电极的构造进行了改进，将两个独立的金电极整合在同一个工作电极上，即在同 一电极表面上的不同区域嵌入两个面积相同的金片(02mm)，构成双金电极集成式工作电 极，设计了基于双组探针检测的新型传感检测方法，即将两组分别与待测祀标dsDNA两条 序列部分互补的捕获探针修饰在双金电极集成式工作电极的不同区域，实现对祀标dsDNA 两条序列的同时检测，有利于提高探针与dsDNA的杂交效率，同时缩短实验工时，节约实验 成本W及所需检测样本用量，有助于阵列传感器日后实现对临床实际样品中dsDNA的直接 检测。
[0006] 下面所述的为本发明人率先将基于多信号放大技术的双金电极集成式电化学DNA 传感器应用于快速检测PML/RAR a融合基因dsDNA片段；本实验针对APL中PML/RAR a融 合基因的相关碱基序列，设计了两组检测探针（每组检测探针包含了一条捕获探针和两条 报告探针），同时对工作电极进行优化，设计了双金电极集成式工作电极，并与酶联放大技 术相结合构建一种新型的明治"构型多信号放大电化学DNA传感模式，并将其用于人工 合成的PML/RARa融合基因dsDNA的检测。
[0007] 该传感模式包含有两组检测探针，每组探针各包含有一条修饰琉基的捕获探针 (CapUireprobe,C)和两条修饰有生物素的报告探针（^Reporterprobe,W下简称时，且该 两组探针（W下简称Ca/RalRa2和Cb/化1化2)分别与祀标dsDNA中相应的两条ssDNA(W 下简称Sa和訊）部分基因序列存在互补。其中，修饰有琉基的捕获探针（W下简称化和Cb)能够通过自组装分别固定到双金电极集成式工作电极相应的区域上，而过量的报告探 针（W下简称Ral、Ra2、化1和化2)则提前加入到含有待测祀标dsDNA的杂交溶液中进行 热变性后置于冰浴中W确保杂交液中的DNA序列均保持ssDNA状态，并将修饰了化和Cb的 工作电极放入含有报告探针Ral、Ra2、化1、化2和祀标dsDNA的待测溶液中进行杂交反应。 通过杂交反应，在工作电极表不同区域面形成了两组明治"传感模式。此时生物素已通 过杂交修饰到电极表面，亲和素修饰的辣根过氧化物酶可W与生物素相互识别，将辣根过 氧化物酶结合到工作电极上。最后，可将工作电极置于由3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB) 和&〇2组成的检测底液，通过HRP催化使得H2〇2氧化TMB产生电化学信号，利用电化学工作 站进行信号采集。若溶液中不含祀标dsDNA，则杂交反应无法进行，工作电极界面上无法形 成明治"构型传感模式，那么HRP也就无法固定到电极表面，电极无法对检测底液进行 催化，所W电化学工作站检测到的电流信号很弱。通过对所采集到的电流信号变化进行比 较，就可W说明杂交反应是否进行，溶液中是否含有祀标dsDNA。该传感模式通过多信号放 大技术、双探针模式和酶的催化功能，极大地增强了该检测方法测定双链DNA的特异性及 灵敏度，从而建立了高灵敏度、高特异性的急性早幼粒细胞白血病基因检测方法，应用于有 效解决急性早幼粒细胞白血病早期诊断该一临床迫切的实际问题，无疑具有极其重要的意 义。
【发明内容】
[000引本发明的目的在于提供一种基于多信号放大技术的双金电极集成式电化学DNA传感器及其检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融合基因dsDNA的方法，旨在解决临床 实际样品中DNA多W双链片段形式存在，双链片段中与祀标单链DNA相互补的另一条DNA 链容易对探针的检测造成干扰，影响检测效果，且现有检测方法灵敏度低、检测周期长、价 格昂贵等。
[0009] 本发明目的是该样实现的，一种检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融合基因 的双电极传感器，包括有两组检测探针，其特征在于一组检测探针是一捕获探针和两报告 探针，另一组检测探针是另一捕获探针和另两报告探针，在同一电极表面上的不同区域嵌 入两个面积相同的金片而构成双金电极集成式工作电极，将两捕获探针相应固定在双金电 极集成式工作电极不同区域的两个面积相同的金片上，对电极表面未结合的位点通过封闭 剂进行封闭；将两组检测探针中的四个报告探针提前混于含有祀标dsDNA的杂交液中，通 过高温变性使双链DNA解链成单链，并将变性后的杂交液置于冰浴中保持杂交溶液中DNA 单链状态；两条单链祀标DNA的一端分别与两条5'端标记有生物素的报告探针和两条3' 端标记有生物素的报告探针杂交，然后利用两条长链祀标链的另一端分别与捕获探针通过 碱基配对结合实现共杂交，将分别与两组探针新形成dsDNA片段固定在工作电极相应的区 域上；通过辣根过氧化物酶上的链霉亲和素，根据亲和素与生物素之间的亲和作用，将酶结 合上去，利用酶的信号放大作用，将修饰电极同时置于相同的底物3, 3'，5, 5' -四甲基联苯 胺中，利用电化学双通道工作站同时采集电信号。
[0010] 所述一组检测探针中的捕获探针基因采用；5'-TCAATGGCTGCCTCCCCGGCGC TTTTTTTTTT-C6-SH-3' ； 一组检测探针中的一报告探针基因采用；5' -biotin-GAGGGC TGGGCACTATCTCTTCAGAACTGCTG-3';-组检测探针中的另一报告探针基因采用； 5' -biotin-AGGCTTGTAGATGCGGGGTAGAGGGGGTG-3' ；另一组检测探针中的捕获探 针基因采用；5' -SH-C6-TTTTTTTTTTCGGGGAGGCAGCCATTGAGACCCAGA-3'；另一组检 测探针中的一报告探针基因采用；5'-CCAGCCCTCCCTCGCCACCCCC-biotin-3' ；另一 组检测探针中的另一报告探针基因采用；5'-TCTACAAGCCTTGCTTTGTCTGTCAGGACA AGTCCTCA-biotin-3'。
[0011] 本发明检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融合基因的方法，包括如下步骤； 待检测基因为急性早幼粒细胞白血病的PML/RARa融合基因，95 %的APL病人为tl5 ; 17q22;q21，在PML和RARa基因发生断裂时，RARa基因断裂点较为固定，发生在第2内含 子，在与RARa基因发生融合时，PML基因的断裂点通常集中在S个区域，分别称为bcrl、 bcr2和bcr3。Bcrl位于PML的第6内含子，形成长型融合基因，约占病人的55% ;bcr2位 于PML的第6外显子，在与RARa第3外显子融合区内常常插入RARa第2内含子中的3~ 12化P，形成V型融合基因，约占病人的5 % ;bcr3位于PML的第3内含子，形成S型融合基 因，约占病人的40 %，为了实现对AI^L的PML/RARa融合基因的检测，从NCBI基因数据库中 查找L型、V型及S型PML/RARa融合基因dsDNA的融合位点，选择位点前后的碱基作为 人工合成的两组检测探针使用，检测探针长度为22~38碱基，经过同源比对，同时利用相 关生物学软件对两组检测探针与其相应的祀标序列两两间的解链温度进行模拟，W确保探 针的特异性，将对应序列作为APL的特异性序列进行合成，采用电化学酶链放大检测方法 应用双通道电化学工作站检测A化的PML/RARa融合基因dsDNA，实现对PML/RARa融合基 因dsDNA的定性定量检测。
[001引所述的待检测APL的PML/RARa融合基因型别，当为L型融合基因时，设计两组 检测探针，分别是一组检测探针中的捕获探针和两报告探针W及另一组检测探针中的捕获 探针和两报告探针，其中一组检测探针中的捕获探针基因采用；5'-TCAATGGCTGCCTCC CCGGCGCTTTTTTTTTT-C6-SH-3'；一组检测探针中的一报告探针基因采用；5' -biotin-GAG GGCTGGGCACTATCTCTTCAGMCTGCTG-3';-组检测探针中的另一报告探针基因采用； 5' -biotin-AGGCTTGTAGATGCGGGGTAGAGGGGGTG-3' ；另一组检测探针中的捕获探 针基因采用；5' -SH-C6-TTTTTTTTTTCGGGGAGGCAGCCATTGAGACCCAGA-3'；另一组检 测探针中的一报告探针基因采用；5'-CCAGCCCTCCCTCGCCACCCCC-biotin-3' ；另一 组检测探针中的另一报告探针基因采用；5'-TCTACAAGCCTTGCTTTGTCTGTCAGGACA AGTCCTCA-biotin-3'。
[001引所述的检测急性早幼粒细