alRa2或者Cb/化1化2)所检测出来的电流信号已接近空白背景信号， 而两组探针（Ca/RalRa化Cb/化1化2)组成的双金电极集成式电化学DNA阵列传感器则仍 可检测出1. 0Xl〇-i2mol/L的祀标dsDNA，且在5. 0Xl〇-n~5. 0X10 -"mol/L浓度范围内， 与祀标dsDNA的浓度对数呈较好的线性关系（图4(C))，其相关的回归方程为I(nA)= 450. 3427+236. 81071gCdsDNA(pmol/L)，r= 0. 9836,检测限可达 7.IXl〇-i4mol/L。由此可见 通过增加了修饰有生物素的报告探针的种类和数量，在有效防止待测祀标dsDNA自身复性 的同时，也增加了修饰在电极表面上催化酶的数量，增大检测电流强度，可W实现对人工合 成的PML/RARadsDNA片段的定量检测，且具有较高的灵敏度。
[0096] 本发明检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融合基因dsDNA片段具有高灵敏 度，高特异性的特点，且相对其它的检测方法成本低。本发明适应于；急性早幼粒细胞白血 病基因型与肿瘤相关性的研究，白血病发生和发展的检测。
[0097] W上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用W限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种基于多信号放大技术的双电极传感器，包括有两组检测探针，其特征在于一组 检测探针是一捕获探针和两报告探针，另一组检测探针是另一捕获探针和另两报告探针， 在同一电极表面上的不同区域嵌入两个面积相同的金片而构成双金电极集成式工作电极， 将两捕获探针相应固定在双金电极集成式工作电极不同区域的两个面积相同的金片上，对 电极表面未结合的位点通过封闭剂进行封闭；将两组检测探针中的四个报告探针提前混于 含有靶标dsDNA的杂交液中，通过高温变性使双链DNA解链成单链，并将变性后的杂交 液置于冰浴中保持杂交溶液中DNA单链状态；两条单链靶标DNA的一端分别与两条5' 端标记有生物素的报告探针和两条3'端标记有生物素的报告探针杂交，然后利用两条长 链靶标链的另一端分别与捕获探针通过碱基配对结合实现共杂交，将分别与两组探针新形 成dsDNA片段固定在工作电极相应的区域上；通过辣根过氧化物酶上的链霉亲和素，根据 亲和素与生物素之间的亲和作用，将酶结合上去，利用酶的信号放大作用，将修饰电极同时 置于相同的底物3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺中，利用电化学双通道工作站同时采集电信号。2. 根据权利要求1所述的基于多信号放大技术的双电极传感器，其特征在于所述一组 检测探针中的捕获探针基因采用：5'-TCA ATG GCT GCC TCC CCG GCGC ITrmTTIT -C6-SH -3'； 一组检测探针中的一报告探针基因采用：5'-biotin-GAG GGC TGG GCA CTA TCT CTT CAG AAC TGC TG -3' ； 一组检测探针中的另一报告探针基因采用：5' -biotin-AGG CTT GTA GAT GCG GGG TAG AGG GGG TG -3' ；另一组检测探针中的捕获探针基因采用：5' - SH -C6- ITITITITIT CGG GGA GGC AGC CAT TGA GAC CCA GA-3' ；另一组检测探针中的一报 告探针基因采用：5' -CCA GCC CTC CCT CGC CAC CCC C -biotin-3' ；另一组检测探针中 的另一报告探针基因采用：5'_ TCT ACA AGC CTT GCT ITG TCT GTC AGG ACA AGT CCT CA -biotin_3,〇3. -种基于多信号放大技术的双电极传感器检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARa 融合基因的方法，包括如下步骤：待检测基因为急性早幼粒细胞白血病的PML/RARa融合 基因，95%的APL病人为tl5; 17 q22;q21，在PML和RARa基因发生断裂时，RARa基因 断裂点较为固定，发生在第2内含子，在与RARa基因发生融合时，PML基因的断裂点通 常集中在三个区域，分别称为bcrl、bcr2和bcr3;Bcrl位于PML的第6内含子，形成长 型融合基因，约占病人的55% ;bcr2位于PML的第6外显子，在与RARa第3外显子融合 区内常常插入RARa第2内含子中的3~127 bp，形成V型融合基因，约占病人的5%;bcr3 位于PML的第3内含子，形成S型融合基因，约占病人的40%，为了实现对APL的PML/RARa 融合基因的检测，从NCBI基因数据库中查找L型、V型及S型PML/RARa融合基因dsDNA 的融合位点，选择位点前后的碱基作为人工合成的两组检测探针使用，检测探针长度为22 ~ 38碱基，经过同源比对，同时利用相关生物学软件对两组检测探针与其相应的靶标序列 两两间的解链温度进行模拟，以确保探针的特异性，将对应序列作为APL的特异性序列进 行合成，采用电化学酶链放大检测方法应用双通道电化学工作站检测APL的PML/RARa融 合基因dsDNA，实现对PML/RARa融合基因dsDNA的定性定量检测。4. 根据权利要求3所述的检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融合基因dsDNA 的方法，其特征在于所述的待检测APL的PML/RARa融合基因型别，当为L型融合基因 时，设计两组检测探针，分别是一组检测探针中的捕获探针和两报告探针以及另一组检测 探针中的捕获探针和两报告探针，其中一组检测探针中的捕获探针基因采用：5' -TCA ATG GCT GCC TCC CCG GCGC rmrmTT -C6-SH -3';一组检测探针中的一报告探针基因采用： 5' -biotin-GAG GGC TGG GCA CTA TCT CTT CAG AAC TGC TG -3' ；一组检测探针中的另一 报告探针基因采用：5' -biotin-AGG CTT GTA GAT GCG GGG TAG AGG GGG TG -3' ；另一 组检测探针中的捕获探针基因采用：5'_ SH -C6- rmrmTT CGG GGA GGC AGC CAT TGA GAC CCA GA-3';另一组检测探针中的一报告探针基因采用：5' -CCA GCC CTC CCT CGC CAC CCC C -biotin-3' ；另一组检测探针中的另一报告探针基因采用：5' - TCT ACA AGC CTT GCT TTG TCT GTC AGG ACA AGT CCT CA -biotin-3'。5. 根据权利要求3或4所述的检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融合基因 dsDNA的方法，其特征在于依序包括如下步骤：（1)采用自组装膜法固定捕获探针，根据带 巯基的捕获探针在金电极表面可以形成自组装单分子膜的特性，将两捕获探针分别固定在 双金电极集成式工作电极不同区域的两个面积相同的金片上，对电极表面未结合的位点通 过封闭剂进行封闭，采用巯基己醇，巯基乙酸，牛血清白蛋白或酪蛋白；（2)将报告探针提 前混于含有靶标dsDNA的杂交液中，通过高温变性使双链DNA解链成单链，并将变性后 的杂交液置于冰浴中保持杂交溶液中DNA单链状态；（3)变性后的两条单链靶标DNA的 一端分别与5'端标记有生物素的报告探针和3'端标记有生物素的报告探针杂交，然后 利用两条长链靶标链的另一端分别与两捕获探针通过碱基配对结合实现共杂交，将分别与 两组探针新形成dsDNA片段固定在工作电极相应的区域上；（4)通过辣根过氧化物酶上 的链霉亲和素，根据亲和素与生物素之间的亲和作用，将酶结合上去，利用酶的信号放大作 用，将修饰电极同时置于相同的底物3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺中，利用电化学双通道工作 站同时采集电信号。6. 根据权利要求5所述的检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融合基因dsDNA的 方法，其特征在于每组检测探针包含一条捕获探针和两条报告探针，四条报告探针加入到 靶标双链DNA中一同变性后，在最佳条件下进行杂交，能够有效的防止原有靶标两条互补 链之间的自身复性，提高杂交效率，有利于提高探针识别靶标DNA的效率，同时达到放大 检测信号的目的，提高检测方法的灵敏性。7. 根据权利要求5所述的检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融合基因dsDNA的 方法，其特征在于将酶固定在修饰有生物素的工作电极表面之前，需采用封闭剂防止电极 表面的非特异性吸附，以消除0. 1% BSA非特异性吸附。8. 根据权利要求5所述的检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融合基因dsDNA的 方法，其特征在于将酶固定在修饰有生物素的工作电极表面后，需采用洗脱液除去电极表 面的非特异性吸附，以消除〇. 1% Tween-PBS、PBS非特异性吸附。9. 权利要求3-8任一所述的检测急性早幼粒细胞白血病PML/RARa融合基因dsDNA 的方法，其特征在于对探针的特异性及灵敏度进行测试，实现对急性早幼粒细胞白血病 PML/RARa融合基因dsDNA的定量检测。
【专利摘要】本发明公开一种基于多信号放大技术的双电极传感器检测急早幼粒PML/RARα基因序列的方法，将两个独立的金电极整合在同一个工作电极上，即在同一电极表面上的不同区域嵌入两个面积相同的金片，构成双金电极集成式工作电极，可以实现在同一工作电极上直接组装两组不同序列的检测探针用以分别测定PML/RARα融合基因 dsDNA的两条互补序列；采用多信号放大技术、双探针检测方法与电化学酶联放大技术实现同时检测APL的PML/RARα融合基因双链DNA中的两条互补链。采集两组探针与相对应的互补链杂交后催化产生的电流信号并进行计算处理，可定量检测靶标dsDNA。实现了对急性早幼粒细胞白血病的早期诊断。
【IPC分类】C12N15/11, G01N27/327, C12Q1/68
【公开号】CN104988214
【申请号】CN201510296965
【发明人】林新华, 刘爱林, 陈元仲, 王昆
【申请人】福建医科大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月3日