水霉菌伊文思蓝活体染色方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水产养殖病害防控技术领域，具体涉及水生动物寄生水霉的伊文思蓝活体染色法方法。本发明简单、易行，适合科研院所、学校、技术推广站及水产养殖公司应用。
技术背景
[0002]水霉病是水生动物(如:鱼、虾、蟹、龟、蛙等)体表的一种水霉寄生病，水霉对寄主无严格选择性，各种水生动物，从卵到各龄成体都可感染。当水生动物体表皮肤因物理化学因素，或细菌、病毒感染受损伤时，水霉的游动孢子侵入伤口，吸取皮肤及其组织内的营养而迅速生长，菌丝与伤口的组织细胞缠绕粘附，使组织发炎、坏死，水生动物因负担过重，游动失常，食欲减退，很快瘦弱死亡。水霉在寄主死后不久繁殖特别快，所以具腐生性，对水产动物是一种继发性感染。长期以来，水霉病的防治是水生动物病害防治中最棘手的一个难题之一，水霉病的频发给全球水产养殖业带来巨大的经济损失。为了更好地开展对水霉病的防治工作，国内外许多科学家都致力于水霉属(Saprolegnia)的研宄。
[0003]在防治水霉药物的筛选过程中，需要知道药物在药物片理后的效果，常需进行活体培养，如:CN 103536586 A，水霉菌丝杀灭实验中，用无菌镊子取出浸泡过的水霉小块置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，25°C培养观察5d。孵育期每24h观察一次，肉眼判定无水霉菌落生长的，表示此种药物在该浓度该作用时间下对水霉菌丝具有杀灭作用。每个浓度设两个对照，同时设经蒸馏水浸泡过的水霉块空白对照。由于培养试验时间长，费工费时，故经常会殆误最佳防治时机，给水产动物养殖者带来经济损，所以从科研、应用的实际出发，急需设计一种快速判断水霉菌活力的方法。
[0004]本发明本着廉价、易得、操作简易、直观快速的原则设计出一种水霉伊文思蓝活体染色法。该发明因简单、易行、快速等特点，非常适合科研院所、技术推广部门和基层水产养殖单位应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种水霉伊文思蓝活体染色法。
[0006]本发明的目的通过以下技术方案实现:
[0007]水霉伊文思蓝活体染色方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0008](I)从水生动物体表取少量含水霉菌丝的组织或带有水霉菌的卵在75%的酒精中浸泡2-3min，用无菌水冲洗数次后置于PDA链霉素半固体平板中央，平板倒置，在20-25 °C条件下培养；
[0009](2)切取步骤(I)平板中菌落边缘的菌丝块，在75%的酒精中浸泡2-5seC，用无菌水冲洗后将菌丝面朝下反接种到新的PDA半固体平板的中央，均匀在平板空白处放入水霉菌诱饵；半固体将平板倒置放入20-25?恒温培养恒温继续培养，待诱饵上覆盖菌丝后将其取出并置于无菌水的6孔板中，于20-25?培养直至游动孢子释放；吸取100 μ L孢子悬液至PDA半固体平板上均匀涂布，20-25°C恒温培养并切取单菌落琼脂块到PDA半固体平板上进行纯化培养；提纯后的水霉菌株可置于4°C保存；
[0010](3)用2-5%。的伊文思蓝染液，浸染水霉菌丝、孢子Ι-lOmin，然后显微镜检观察，着蓝色者为死细胞；不着色者为活细胞；
[0011](4)根据未着色细胞占整体细胞的比例，可计算出活细胞的百分率；死细胞百分率(％ ) = 100 —活细胞百分率。
[0012]进一步地，步骤⑴中所述PDA链霉素平板的制备方法为:①配制PDA半固体培养基，配方如下:马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂条6g或琼脂粉4g，自来水1000ml ;②将PDA半固体培养基溶化后，冷却至45-60°C，注入200mg/l的链霉素，制成平板。
[0013]伊文思蓝染液配制方法:伊文思蓝2-5g，用无菌水定容至1000ml。
[0014]本发明的具体方法为:
[0015]1、PDA半固体培养基的制作:
[0016]A、配方:
[0017]马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000ml，琼脂条6g (或琼脂粉4g)自然pH。
[0018]B、制法:
[0019]马铃薯去皮后，切成小块，加水煮烂(煮沸20-30min，能被玻璃棒戳破即可)，用4层纱布过滤，再加入糖与琼脂，加热融化后补足水到1000ml，分装于三角瓶中，用纱布+牛皮纸(报纸)+棉线扎封口。然后在于121°C条件下灭菌20min。
[0020]*注意事项:
[0021]⑴、三角瓶中的装液量以不超过总容量的1/2?3/5为宜，以防止灭菌时培养基在沸腾中沾污纱布及存放中易导致瓶内培养基染菌等。
[0022]⑵、用高压灭菌锅时要注意排冷空气，防止“假升镑”现象。
[0023]⑶、培养皿在清洗后，用纸包好可在高压灭菌锅中于121°C条件下灭菌15-20min，待自然降压为“O”后，取出置于干燥箱中烘干，等降温后置于超净工作台中备用。(也采取干法灭菌:将培养皿在清洗后，用纸包好置于160°C的烘箱中灭菌2h后备用)
[0024]C、倒平板:
[0025]灭过菌后的培养基与培养皿放在超净工作台中，先用紫外线灭菌15min后关掉紫外灯，后打开风机使超净工作台中呈正压状态；操作员的双手洗净后，用酒精棉球擦拭后伸入操作台中，等培养基降温到45-60°C后在酒精灯旁将培养基倒入培养皿中，每皿中倒入15ml左右(注意:据有关资料报道琼脂在43°C以下会凝固，故倒平板时培养基的温度高一些，可提高培养基的流动性)，倒平板后放置到第二天使用(等培养基中的冷凝水干后使用一为加快速度可用“叠皿法”倒平板且倒后平板后加大超净工作台中的风量)。
[0026]*相关的微生物操作方法:可参考周德庆《微生物学实验教程》第2版
[0027]2、水霉株的分离、提纯培养:
[0028]分离:
[0029]从水生动物体表取少量含水霉菌丝的组织或将带有水霉菌的卵先在75%的酒精中浸泡2-3min，用无菌水冲洗数次后置于PDA链霉素平板(将PDA半固体培养基溶化后，冷却至45-60°C，注入200mg/L的链霉素，制成平板)，中央，平板倒置在20-25°C条件下培养。
[0030]提纯:
[0031]在酒精灯下用灼烧冷却后的解剖刀切取分离平板中菌落边缘的菌丝块(2*2-5*5mm2)在75%的酒精中浸泡2-5seC，迅速用无菌水冲选后反