用于检测细菌性阴道病的试剂盒及其制备方法和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及阴道疾病检测技术领域，尤其设及一种用于检测细菌性阴道病的试剂 盒，W及该种试剂盒的制备方法和使用该试剂盒检测细菌性阴道病的方法。
【背景技术】
[000引细菌性阴道病化acteralvaginosis,BV)是育龄妇女常见的一种阴道感染性疾 病，是由于阴道正常菌群的生态平衡发生素乱，优势菌群乳酸杆菌减少或消失，而阴道加特 纳菌、厌氧菌、弯曲弧菌等微生物过度生长所致的无阴道粘膜炎性改变的混合感染。BV可导 致组织性绒毛膜炎、羊水感染、剖腹手术后子宫内膜炎及其他妊娠不良和妊娠并发症，并与 妇科常见疾病如输卵管炎、盆腔炎、宫外孕、不孕症、泌尿系统感染、术后感染及妇科肿瘤密 切相关。
[000引 目前临床诊断BV的标准是Amsel法，下列4项中有S项阳性，即可临床诊断为细 菌性阴道病。（1)均质、稀薄、白色阴道分泌物，常粘附于阴道壁；（2)线索细胞（cluecell) 阳性；0)阴道分泌物抑> 4. 5 ; (4)胺臭味实验（whifftest)阳性。Amsel法为基本的 临床诊断方法，该方法成本低廉，但实际应用中受很多因素的影响，在临床准确实施并非易 事。观察阴道分泌物时常受到主观因素的干扰，尤其合并其他种类的阴道炎症时阴道分泌 物不典型，白带性状的判定常给临床医生带来困惑。作为BV诊断最佳指标的线索细胞的识 别则受到显微设备的质量、样本的采集W及操作者的经验等诸多因素的共同影响。也有观 点认为其仍不能提供最准确的诊断，原因在于碎片及退化的细胞有时会被误认为是线索细 胞。抑值测定与胺实验敏感但不特异，近期性交、阴道灌洗、处于月经期及阴道分泌物中混 有大量宫颈粘液等，可导致抑值升高或使分泌物产生异味。Amsel法结果判断客观性、重复 性不好，易受到主观影响，可能漏诊、误诊。（"重复性不好"针对的是不同的医生因为经验 技术的不同，检测的结果可能不一样。金标准的准确实施需要临床医生充足的经验，目前临 床实施金标准普遍只用单项的指标，如只做胺实验，或只看线索细胞。）
[0004]除Amsel法临床诊断标准外，还可W根据阴道分泌物涂片的Nugent革兰氏染色评 分对BV进行诊断。评分为乳杆菌分值、阴道加德纳菌和类杆菌分值、染色不定弯曲小杆菌 分值之和，按每10个油镜视野所观察到的每种细菌的平均数量进行计算和分值分配。分 值范围为0-10,BV的诊断标准为>7分，分值在4-6分为临界范围，分值在0-3为正常。 Nugent法客观性、重复性好，但对技术人员要求较高，操作步骤复杂，需要经过涂片、革兰氏 染色、高倍镜下计数、分值计算等步骤，耗时间较长、临床不易推广。且易受标本的采集、检 验师的经验、染色差异及涂片的均匀度等多方面影响。
【发明内容】
[0005] 本发明针对现有的细菌性阴道病检测方法存在判断主观性大，结果重复性不好， 或对检测技术人员要求高、检测步骤复杂的问题，提供一种用于检测细菌性阴道病的试剂 盒，W及该种试剂盒的制备方法和使用该试剂盒检测细菌性阴道病的方法。应用该试剂盒 检测细菌性阴道病的客观性和重复性好且检测步骤简单、检测结果准确。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用W下技术方案。
[0007] 一种用于检测细菌性阴道病的试剂盒，包括反应液和显色剂，所述反应液由 0. 2-0. 3g/L的5-漠-4-氯-3-嘲噪基a-D-N-己酷神经氨酸盐、0. 2-0. 3g/L的对哲基苯 甲酸己醋钢和复合缓冲液组成；所述显色剂由0. 45-0. 55mg/L的4-氨基安替比林（4-AAP) 和缓冲液组成。
[000引优选的，所述反应液由0. 25g/L的5-漠-4-氯-3-嘲噪基a-D-N-己酷神经氨酸 盐、0. 25g/L的对哲基苯甲酸己醋钢和复合缓冲液组成。
[0009] 优选的，所述显色剂由0. 5mg/L的4-氨基安替比林（4-AA巧和缓冲液组成。
[0010] 优选的，反应液中的复合缓冲液由抑=7. 2的磯酸盐缓冲液与抑=5. 0的己酸 钢缓冲液等体积混合组成。
[0011] 优选的，显色剂中的缓冲液为抑=7. 2的磯酸盐缓冲液。
[0012] W上所述用于检测细菌性阴道病的试剂盒的制备方法，包括W下步骤：
[0013] S1制备反应液；向复合缓冲液中加入对哲基苯甲酸己醋钢并揽拌均匀，得混合 液；静置混合液30min，接着再在揽拌的条件下向混合液中加入5-漠-4-氯-3-嘲噪基 曰-D-N-己酷神经氨酸盐，5-漠-4-氯-3-嘲噪基a-D-N-己酷神经氨酸盐完全溶解后，制 得反应液。
[0014] 复合缓冲液的配制；将抑=7. 2的磯酸盐缓冲液与抑=5. 0的己酸钢缓冲液等 体积混合，形成复合缓冲液。
[0015] S2制备显色剂；向缓冲溶中加入4-AAP，揽拌均匀，制得显色剂。优选的，所述缓冲 液为抑=7. 2的磯酸盐缓冲液。
[0016] 应用W上所述试剂盒的细菌性阴道病的检测方法，包括W下步骤：将待测样本 洗脱至反应液中并使待测样本在反应液中分散，得待测液；将待测液置于37+rc中静置 lOmin;接着向待测液中加入显色剂，观察待测液的颜色；若待测液的颜色为黄色，检测结 果为阴性；若待测液的颜色为绿色至藍色，检测结果为阳性（待测液的颜色越深，说明唾液 酸巧酶的活性越高）。
[0017] 优选的，检测方法中使用的反应液与显色剂的体积比为10:3。
[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的反应液W5-漠-4-氯-3-嘲噪 基a-D-N-己酷神经氨酸盐为反应底物，反应底物与待测样本中的唾液酸巧酶作用，使唾 液酸巧酶分解并释放出漠嘲噪基，漠嘲噪基与显色剂作用后，待测液颜色会发生变化，从而 可根据待测液的颜色直接判断检测结果。在反应液中加入对哲基苯甲酸己醋钢，不仅可防 止真菌的生长，还可使反应底物与唾液酸巧酶进行更充分的反应，提高检测的灵敏度和特 异性。反应液中使用复合缓冲液，复合缓冲液由抑=7. 2的磯酸盐缓冲液与抑=5. 0的己 酸钢缓冲液等体积混合组成，可进一步提高检测的灵敏度和特异性，并可缩短检测所需时 间，待测液只需置于37±rC中lOmin即可进行显色反应，提高检测效率。应用本发明提供 的试剂盒检测细菌性阴道病，具有简单、快速、灵敏度高和特异性好的特点，并且性价比高， 适用于临床快速检测。
【具体实施方式】
[0019] 为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作 进一步介绍和说明。
[0020] 实施例
[0021] 本实施例提供一种用于检测细菌性阴道病的试剂盒和试剂盒的制备方法，W及使 用该试剂盒检测细菌性阴道病的检测方法。
[002引1、0. 02mol/L的磯酸盐缓冲液加=7.2)的制备；
[0023]选用分析纯级磯酸二氨钢（化畔〇4? 2&0)和磯酸氨二钢（化2册〇4? 12&0)，用分 析天平分别称取4.Og磯酸二氨钢和4. 5g磯酸氨二钢，将磯酸二氨钢和磯酸氨二钢溶解 于lOOOmL的纯化水中，揽拌至磯酸二氨钢和磯酸氨二钢完全溶解，然后用纯化水补充至 2000mL，制得抑=7. 2的磯酸盐缓冲液。按该方法制备充足的磯酸盐缓冲液（pH= 7. 2)， 备用。
[0024] 2、0. 02mol/L的己酸钢缓冲液（pH= 5. 0)的制备；
[0025] 选用分析纯级无水己酸钢，用分析天平称取3. 3g无水己酸钢，将无水己酸钢溶解 于lOOOmL的纯化水中，揽拌至无水己酸钢完全溶解，然后用纯化水补充至2000mU接着用 冰醋酸调节溶液的抑至5. 0,制得抑=5. 0的己酸钢缓冲液。按该方法制备充足的己酸钢 缓冲浓（pH= 5. 0),备用。
[0026] 3、反应液的制备
[0027] 将2000血，0. 02mol/L的磯酸盐缓冲液（pH= 7.。与2000血，0. 02mol/L的己酸 钢缓冲液（pH= 5. 0)等体积混合，形成复合缓冲液。
[002引向复合缓冲液中加入l.Og对哲基苯甲酸己醋钢，揽拌至对哲基苯甲酸己醋钢完 全溶解，得混合液。
[0029] 静置混合液30min，接着再在揽拌的条件下向混合液中加入1.Og的 5-漠-4-氯-3-嘲噪基a-D-N-己酷神经氨酸盐，揽拌至5-漠-4-氯-3-嘲噪基a-D-N-己 酷神经氨酸盐完全溶解后，制得反应液。
[0030] 分装反应液，常温储存备用。
[0031] 在其它实施方案中，还可配置5-漠-4-氯-3-嘲噪基a-D-N-己酷神经氨酸盐的 浓度为0. 2-0. 3g/l，对哲基苯甲酸己醋钢的浓度为0. 2-0. 3g/L的反应液。
[003引 3、显色剂的制备
[0033] 用分析天平称取0.5mg的4-AAP纯品，将4-AAP溶解于lOOOmL，0.02mol/L的磯酸 盐缓冲液（pH= 7. 2)中，制得4-AAP的浓度为0. 50mg/L的显色剂。
[0034] 分装显色剂，常温储存备用。
[0035] 在其它实施方案中，还可W配置4-AAP的浓度为0.45-0. 55mg/L的显色剂。
[0036] 由反应液和显色剂组成用于检测细菌性阴道病的试剂盒。
[0037] 4、使用试剂盒检测细菌性阴道病
[003引将待测样本洗脱至500yL的反应液中并使待测样本在反应液中分散，得待测液； 将待测液置于37+rC中静置lOmin;接着向待测液中加入150yL的显色剂。在3min内观 察待测液的颜色；若待测液的颜色为黄色，检测结果为BV阴性；若待测液的颜色为绿色至 藍色，检测结果为BV阳性（待测液的颜色越深，说明唾液酸巧酶的活性越高）。
[0039]实验1;灵敏度实验
[0040] 试验方法；使用上述实施例中的用于检测细菌性阴道病的试剂盒（唾液酸巧酶 法），分别检测浓度为OU/mL、抓/mL、抓/mL、7U/mL、8U/mL、9U/mL的唾液酸巧酶溶液，根据试 剂盒对系列浓度的唾液酸巧酶溶液的检测结果来确定试剂盒的灵敏度。
[0041] 具体步骤：
[0042] (1)系列浓度唾液酸巧酶溶液的配制；取唾液酸巧酶冻干品（sigma)，用0.02mol/ LpH7. 3磯酸盐-50%甘油-5%BSA缓冲液将唾液酸巧酶冻干品稀释，制备成浓度分别为 0U/20UL、抓/20uL、抓/20uL、7U/20uL、8U/20uL、9U/20uL的唾液酸巧酶原液。
[0043] (2)取6支反应管（每支反应管中含反应液490uL)，打开反应管盖，向6支反应管 中对应加入lOuL浓度为 0U/20UL、抓/20uL、抓/20uL、7U/20uL、8U/20uL、9U/20uL的唾液酸 巧酶原液，6支反应管中唾液酸巧酶的浓度分别是OU/