试剂盒及确定待测dna样本预定snp位点的基因型的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及试剂盒及确定待测DNA样本预定SNP位点的基因型的方法。
【背景技术】
[0002] 华发林(Warfarin，也称为"华法林")是临床上最常用的香豆素类口服型强抗凝药 物，广泛用于心脏瓣膜置换、房颤、肺栓塞、再次脑卒中（中风）等深度动静脉血栓性疾病的 预防和治疗。该药物的化学结构为3-(a-苯基丙酮）-4-羟基香豆素，为两种光学同分异构 体R型和S型的消旋体（racemic)混合物，其中S异构体的抗凝作用比R异构体更强3~5 倍。华法林使用剂量在不同种族间及个体间存在较大差异，甚至可相差10到20倍。影响 华法林剂量的因素主要有遗传因素以及身高、体重、年龄、性别、种族、药物相互作用等。华 法林国际药理学联盟在新英格兰发表的研究显示，加入药物基因组学的预测模型(包括基 因型）比临床预测模型(不包括基因型）准确性提高了 80%。所以个体的遗传特征对于华法 林的剂量影响很大。
[0003] 目前研究发现与华法林药效学和药动学相关的基因达30多种，起主要作用的有2 种，VKORCl为其中之一。美国FDA在华法林用药说明书里介绍了 VKORCl基因对剂量的影 响并建议在用药之前做基因检测。VKORCl基因编码的蛋白质为组成维生素 K环氧化物还原 酶复合体亚单位之一，主导维生素 K依赖性凝血因子的生成，是华法林的作用靶点。VKORCl 基因启动子区-1639G > A多态性位点（rs9923231)与华法林临床用药剂量相关。与AA基 因型启动子相比，GG和AG基因型启动子活性高，凝血因子生成较多，患者临床表现出华法 林抵抗。在亚洲人群中研究结果显示，VKORCl的基因多态对华法林剂量差异的影响达到了 16-30%。因而，华法林用药之前，需药个体的VKORCl基因的rs9923231位点的基因型检测 和分型，意义重大。
[0004] 然而，现阶段VKORCl基因的rs9923231位点的检测和基因型分型的方法仍有待改 进。
【发明内容】
[0005] 需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0006] 目前检测SNP位点的最简单的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通过应用特异性限 制性内切酶消化PCR扩增产物，并根据消化位点是否消失来判断其变异存在与否。但该方 法操作复杂，样本量多时易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而 出现假阴性或假阳性结果，可靠性低。多重PCR方法尽管特异性有所提高，但是仍然是基于 普通PCR的原理，引物特异性以及低保真Taq酶等这些因素均可造成对结果的影响。DNA测 序法虽然是目前进行基因诊断的金标准，但步骤繁琐，过程复杂，试剂价格昂贵，容易出现 样本间的交叉污染而导致测序失败；另外测序仪的装备也超出了一般临床检验实验室的承 受范围。高分辨率熔解曲线法是一种快速，简便，经济，实用的分型方法，但基因分型依赖于 仪器温度控制的精密性，假阳性高。Taqman探针杂交法采用特异性的荧光标记的探针，特 异性强，灵敏度高且操作方便，快速。该方法同样被认为是SNP分型的金标准，在临床应用 的前景值得期待。Taqman探针杂交法的原理为：在TaqMan探针法的PCR反应体系中，包括 一对PCR引物和一条探针，探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间，探针 的5'端标记有报告基因，如FAM、VIC，3'端标记有荧光淬灭基团，如MGB TAMRA ;当探针完 整的时候，报告基因所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号；随着PCR的进 行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3' -5'外切核酸酶活性就会将探针切 断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。由此，应用一对双荧光标 记的Taqman探针，分别针对双等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探针才能够扩增出 各自的基因型；用两种荧光信号能够被显著区分的荧光染料分别标记这两种探针，就可以 在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判定。因而，利用该方法进行SNP基因型 分型时，引物和探针的设计至关重要，引物长度、探针长度、引物特异性和探针特异性均会 显著影响检测结果的特异性和敏感性。
[0007] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种能够有效用于VKORCl基因的rs9923231位点检测的试剂盒，以及确定待测 DNA样本的VKORCl基因的rs9923231位点的基因型的方法。
[0008] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂 盒包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列；第二核酸 分子，所述第二核酸分子具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列；第一探针，所述第一探针具 有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列；以及第二探针，所述第二探针具有SEQ ID NO :4所示的 核苷酸序列，其中，所述探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，所述 第一探针与所述第二探针的荧光报告基团不同。
[0009] 根据本发明的实施例，本发明的试剂盒能够用于VKORCl基因的rs9923231位点的 检测。具体地，根据Taqman探针杂交法，利用该试剂盒中的试剂，将待测DNA样本进行荧光 定量PCR后，基于荧光定量PCR结果即可容易地确定VKORCl基因的rs9923231位点的基因 型。进而，可以将VKORCl基因的rs9923231位点的基因型信息，与其他临床信息结合分析， 用于指导待测DNA样本来源的个体的华法林用药。
[0010] 根据本发明的实施例，所述荧光报告基团为FAM或VIC，所述淬灭基团为MGB。
[0011] 根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种确定待测DNA样本预定SNP位点 的基因型的方法，所述预定SNP位点为VKORCl基因的rs9923231位点。根据本发明的实施 例，该方法包括：根据Taqman探针杂交法，利用前面所述的试剂盒，将所述待测DNA样本进 行荧光定量PCR ;以及对荧光定量PCR结果进行分析，以便确定待测样本预定SNP位点的基 因型。
[0012] 根据本发明的实施例，利用本发明的方法能够有效地确定待测DNA样本VKORCl基 因的rs9923231位点的基因型。此外，发明人惊奇地发现，该方法成本低、特异性强、灵敏度 高、准确度高、可重复性好，且在一次PCR反应中即可完成对单个SNP位点的基因型判定，操 作方便、快速。
[0013] 另外，根据本发明上述实施例的确定待测DNA样本预定SNP位点的基因型的方法 还可以具有如下附加的技术特征：
[0014] 根据本发明的实施例，利用ABI Stepone荧光定量PCR仪进行所述荧光定量PCR。 由此，荧光定量PCR结果准确，有利于后续的分析，进而有利于预定SNP位点基因型的确定。
[0015] 根据本发明的实施例，所述突光定量PCR的反应体系为：5重量份的Taqman Genotyping Master Mix ;3. 5重量份的超纯水；0. 5重量份的组合物；以及1重量份的待测 DNA样本，其中，所述组合物由所述第一核酸分子、第二核酸分子、第一探针和第二探针组 成。由此，荧光定量PCR效果好，结果准确，有利于后续的分析，进而有利于预定SNP位点基 因型的确定。
[0016] 根据本发明的实施例，所述待测DNA样本的浓度为20ng/μ 1。由此，荧光定量PCR 效果好，结果准确，有利于后续预定SNP位点基因型的确定。
[0017] 根据本发明的实施例，所述待测DNA样本来源于人唾液或外周血。
[0018] 根据本发明的实施例，所述组合物中每种核酸分子的浓度均为18 μ mol/L，每种探 针的浓度均为5 μ mol/L。由此，荧光定量PCR效果好，结果准确，有利于预定SNP位点基因 型的确定。
[0019] 根据本发明的实施例，所述荧光定量PCR的反应程序为：第一步：60°C下保持30 秒；第二步：95°C下保持1