用于肿瘤诊断和治疗的分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤诊断、研究以及治疗领域，特别涉及肿瘤特异性的融合基因作为 肿瘤诊断分子标志及临床治疗的分子靶标。
【背景技术】
[0002] 随着社会的发展，人们生活环境及饮食习惯等的变迁，恶性肿瘤已经成为人类健 康的头号杀手之一，近年来在全球范围内患病人数不断增加，为全球经济和人类社会的发 展带来了沉重的负担。
[0003] 恶性肿瘤的发生发展是多步骤并伴随多基因遗传或表观遗传发生变化的过程。鉴 定致瘤性的遗传异常是肿瘤研究的一个重要目标，能够为肿瘤治疗提供潜在的靶点。其中 值得注意的是，染色体重排导致两基因的融合，作为一种新的突变形式在肿瘤发病过程中 起着关键作用，它的发现扩展了肿瘤基因的范畴。
[0004] 融合基因作为肿瘤基因新类型，其促进肿瘤发生和恶性转化主要通过两种方式：第一，一个基因的启动子或/和增强子元件等由于染色体重排异常地跟一个原癌基因紧靠 在一起，驱使癌基因的异常表达，例如B细胞肿瘤IG-MYC、T细胞肿瘤TCR-MYC导致癌基因 MYC活化；第二，两基因融合产生有新功能的融合蛋白，例如BCR-ABLl。然而，超过80%的已 知融合基因存在于仅占人类肿瘤的10%的白血病、淋巴瘤、骨及软组织肉瘤中，而在较为常 见上皮性实体瘤却只发现10%融合基因。
[0005] 近年来随着分析及检测方法的进步，肿瘤学家分别在50%前列腺癌和1-5%肺癌 (5-10%非小细胞肺癌)发现新的融合基因 TMPRSS2-ERG，EML4-ALK，并进一步阐明它们的致 癌机制，为前列腺癌和肺癌的分型诊断和靶向治疗奠定基础。可见染色体重排导致两基因 融合同样可以是上皮性实体瘤的癌变机制之一。融合基因因其在肿瘤细胞特异性表达，可 作为理想的治疗靶点，例如针对CML的融合基因 BCR-ABL设计的分子靶向药物imatinib/ Gleevec已经在临床得到应用，同样地临床前及临床1期，2期数据表明ALK激酶抑制剂对 治疗EML4-ALK阳性病人有效。
[0006] 用于癌症的融合基因的研究已经日益成为热点。
[0007] PLEKHA1基因位于10号染色体长臂第二区第6带的第13个亚带（10q26. 13)，存 在3个转录本，以转录本1为例（NM_021622. 4)其转录的mRNA包含12个外显子，编码404 个氨基酸，分子量约45. 5 kDa。该基因编码包含pleckstrin同源性结构域的衔接蛋白， 能通过特异性结合3,4-二磷酸磷脂酰肌醇而定位在细胞膜，因此其可能参与到细胞膜信 号通路传导的过程中。另外，PLEKHA1基因的多态性与一些疾病相关，包括kuhnt-junius degeneration以及macular degeneration,至今其与肿瘤的关系并没有研究。
[0008] TACC2基因位于10号染色体长臂第二区第6带（10q26)，转录产生4个转录本， 以转录本1为例（NM_206862. 2)其转录mRNA包含23个外显子，编码2948个氨基酸，分子 量约309.4 kDa。该基因编码的蛋白包含SPAZ结构域以及C端transforming, acidic coiled-coi 1结构域，主要表达在胞楽以及在细胞周期进展过程中在中心体附近富集。 TACC2蛋白通过C端的TACC结构域与多种分子相互作用，包括与微管相互作用参与细胞的 分裂，与YEATS4、GCN5L2、PCAF等相互作用参与基因的表达调控。之前的研究发现TACC2 与肿瘤的发生发展关系密切，最初TACC2在乳腺癌中被首次发现，并证实其对乳腺癌的进 展起着抑制的作用。最近在前列腺癌的报道中，TACC2起着促癌作用。TACC2与肿瘤关系仍 有待进一步阐明。
[0009] 上述两个基因位于的染色体区域在肿瘤中经常发生异常，揭示该区域与肿瘤的发 生发展密切相关。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于提供一种用于肿瘤的分子标志及其应用。
[0011] 本发明所采取的技术方案是： 用于肿瘤的分子标志，所述分子标志为融合基因 PLEKHA1-TACC2,融合基因同时包含基 因 PLEKHA1和基因 TACC2的部分序列。
[0012] 优选的，上述融合基因 PLEKHA1-TACC2的融合形式选自：PLEKHA1 exon 2 :TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 6 ：TACC2 exon 13, PLEKHA1 exon 10 ：TACC2 exon 17, PLEKHA1 exon 2 ：TACC2 exon 20, PLEKHA1 exon 8 ：TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 10 ：TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 4 ：TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 3 ：TACC2 exon 17, PLEKHA1 exon 9 ： TACC2 exon 23〇
[0013] 特别的，融合基因 PLEKHA1-TACC2至少包含如下序列： PLEKHA1 部分： TGTAATGTTCAAGCTCAGAAATGCCTTATGTGGATCGTCAGAATCGCATTTGTGGTTTTCTAGACATTGAAG AAAATGAAAACAGTGGGAAATTTCTTCGAAGGTACTTCATACTGGATACCAGAGAAGATAGTTTCGTGTGGTACATG GATAATCCACAG (SEQ ID NO ：1)； TACC2部分： AATAAAGAAATAGAAGAACTCACCAAGATTTGTGACGAACTGATTGCCAAAATGGGGAAAAGCTAACTCTGA ACCGAATGTTTTGGACTTAACTGTTGCGTGCAATATGACCGTCGGCACACTGCTGTTCCTCCAGTTCCATGGACAGG TTCTGTTTTCACTTTTTCGTATGCACTACTGTATTTCCTTTCTAAATAAAATTGATTTGATTGTATGCAGTACTAAG GAGACTATCAGAATTTCTTGCTATTGGTTTGCATTTTCCTAGTATAATTCATAGCAAGTTGACCTCAGAGTTCCTGT ATCAGGGAGATTGTCTGATTCTCTAATAAAAGACACATTGCTGACCTTGGCCTTGCCCTTTGTACACAAGTTCCCAG GGTGAGCAGCTTTTGGATTTAATATGAACATGTACAGCGTGCATAGGGACTCTTGCCTTAAGGAGTGTAAACTTGAT CTGCATTTGCTGATTTGTTTTTAAAAAAACAAGAAATGCATGTTTCAAATAAAATTCTCTATTGTAAATAAAATTTT TTCTTTGGATCTTGGCAA (SEQ ID NO ：2)〇
[0014] 一种用于肿瘤临床病理特征和/或预后判断的诊断制剂，制剂中含有可检测上述 任意一项的分子标志或其表达产物的试剂。
[0015] 肿瘤选自头颈部肿瘤，特别是食管鳞癌、鼻咽癌、喉癌或口腔部鳞癌。
[0016] 一种治疗肿瘤的生物制剂，该生物制剂可以使融合基因 PLEKHA1-TACC2在肿瘤细 胞中的表达量下降或者使其表达融合蛋白丧失功能。
[0017] 特别的，上述治疗肿瘤的生物制剂含有siRNA、融合基因 PLEKHA1-TACC2启动子抑 制剂、融合基因 PLEKHA1-TACC2增强子抑制剂、融合基因 PLEKHA1-TACC2表达蛋白抗体中的 至少一种。
[0018] 本发明的有益效果是： 本发明的分子标志，有助于肿瘤的早期诊断以及治疗，提高筛查效率，降低筛查成本， 为个体化治疗提供方向，改善病人的存活率和生存质量。
[0019] 本发明的诊断制剂，通过检测融合基因的表达情况，可以对肿瘤进行早期筛查，有 助于肿瘤的早期介入和预防。
[0020] 本发明的治疗肿瘤的生物制剂，通过使融合基因 PLEKHA1-TACC2的表达量下降， 对肿瘤的进展有一定的治疗作用，具有广阔的开发前景。
【附图说明】
[0021] 图1 :利用RNA-seq发现食管鳞癌存在新的recurrent gene fusion ; 图2 :野生型PLEKHA1和TACC2在不同标本中的表达量； 图3 :过表达融合蛋白对食管癌肿瘤细胞增殖的影响； 图4 :敲降PLEKHA1、TACC2对食管癌肿瘤细胞增殖的影响 图5 :敲降TACC2对细胞周期分布的影响； 图6 :敲降TACC2对肿瘤细胞耐药性的影响； 图7 :融合基因的分析检测流程； 图8 :融合基因 PLEKHA1-TACC2在不同头颈部肿瘤中的测序情况。
【具体实施方式】
[0022] 用于肿瘤的分子标志，所述分子标志为融合基因 PLEKHA1-TACC2,融合基因同时包 含基因 PLEKHA1和基因 TACC2的部分序列。
[0023] 优选的，上述融合基因 PLEKHA1-TACC2的融合形式选自：PLEKHA1 exon 2 :TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 6 ：TACC2 exon 13, PLEKHA1 exon 10 ：TACC2 exon 17, PLEKHA1 exon 2 ：TACC2 exon 20, PLEKHA1 exon 8 ：TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 10 ：TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 4 ：TACC2 exon 23, PLEKHA1 exon 3 ：TACC2 exon 17, PLEKHA1 exon 9 ： TACC2 exon 23〇
[0024] 特别的，融合基因 PLEKHA1-TACC2至少包含如下序列： PLEKHA1 部分： TGTAATGTTCAAGCTCAGAAATGCCTTATGTGGATCGTCAGAATCGCATTTGTGGTTTTCTAGACATTGAAG AAAATGAAAACAGTGGGAAATTTCTTCGAAGGTACTTCATACTGGATACCAGAGAAGATAGTTTCGTGTGGTACATG GATAATCCACAG (SEQ ID NO ：1)； TACC2部分： AATAAAGAAATAGAAGAACTCACCAAGATTTGTGACGAACTGATTGCCAAAATGGGGAAAAGCTAACTCTGA ACCGAATGTTTTGGACTTAACTGTTGCGTGCAATATGACCGTCGGCACACTGCTGTTCCTCCAGTTCCATGGACAGG TTCTGTTTTCACTTTTTCGTATGCACTACTGTATTTCCTTTCTAAATAAAATTGATTTGATTGTATGCAGTACTAAG GAGACTATCAGAATTTCTTGCTATTGGTTTGCATTTTCCTAGTATAATTCATAGCAAGTTGACCTCAGAGTTCCTGT ATCAGGGAGATTGTCTGATTCTCTAATAAAAGACACATTGCTGACCTTGGCCTTGCCCTTTGTACACAAGTTCCCAG GGTGAGCAGCTTTTGGATTTAATATGAACATGTACAGCGTGCATAGGGACTCTTGCCTTAAGGAGTGTAAACTTGAT CTGCATTTGCTGATTTGTTTTTAAAAAAACAAGAAATGCATGTTTCAAATAAAATTCTCTATTGTAAATAAAATTTT TTCTTTGGATCTTGGCAA (SEQ ID NO ：2)〇
[0025] -种