mRNA表达水平检测 发明人利用实时定量PCR(QPCR)在食管癌临床标本及其配对癌旁组织中分别检测野生 型PLEKHA1和TACC2基因的mRNA表达水平。发明人利用Bio-rad公司Sybr-green buffer (#170-8880)以及CFX96平台进行实时定量PCR检测，具体步骤如下： 1)引物设计与合成（invitrogen公司） PLEKHAl-real time-sense :5'-TGTGTAAAACAAGGAGCAGTGATG-3'（SEQ ID NO :5) PLEKHAl-real time-antisense :5'-CATTCCTGGACTTTATGAACCTCT-3'（SEQ ID NO :6) TACC2-real time-sense :5'- GCTATGGAAGCCAATGGAGTG-3'（SEQ ID NO :7) TACC2-real time-antisense :5'- ACTGGTGGTGTTTCTGGTGTAGC-3'（SEQ ID NO :8) GAPDH-real time-sense :5'_ CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3'（SEQ ID NO :9) GAPDH-real time-antisense :5'-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3'（SEQ ID NO :10) 2) QPCR反应体系（10μ I ) 首先将逆转录得到的I μ g cDNA原液稀释，I μ I cDNA原液加19 μ I的DEPC水稀释， 得到的稀释液浓度为50ng/4yl。反应试剂及体系如下：
反应程序：95°C预变性2min，反应一次；95°C变性15sec，60°C退火与延伸30sec，反 应重复40个循环。溶解曲线反应程序为：95°C 15sec; 60°C 15 sec;95°C 30 sec。溶 解曲线的作用是用于判断引物是否特异，有无二聚体干扰或者其他的污染以及扩增曲线可 得出产物扩增的情况。
[0042] 结果分析：目的基因的相对表达量用2_Aet表示，Λ Ct =目的基因 CT -参照基因 CT0
[0043] 从图2可知，两个野生型基因 PLEKHA1和TACC2在食管癌标本中低表达，并且在融 合基因阳性的标本中mRNA表达水平较融合基因阴性的食管癌标本中更低。A和B :PLEKHA1， TACC2在食管癌及其配对的癌旁组织的mRNA表达差异分析；C和D :PLEKHA1和TACC2在融 合基因阳性和阴性的食管癌标本中mRNA表达差异分析。
[0044] 融合基因及野生型基因功能研究 PLEKHA1-TACC2的融合方式多变，通过生物信息学分析和预测，不同融合方式编码不同 的蛋白以及以上的QPCR结果，发明人认为PLEKHA1-TACC2融合基因可通过两种方式促进肿 瘤的发生发展：1.产生致瘤性融合蛋白；2.破坏两个候选抑癌基因，抑制两个抑癌基因的 表达。
[0045] 为了证明以上假设，发明人采用Tet-off诱导表达系统过表达融合蛋白（融合方 式：P-exon 6:T-exon 13经生物信息预测0RF)、瞬时特异性siRNA和稳定shRNA敲降野生 型基因 、MTT assay、细胞周期检测、耐药性检测等实验进行功能研究，具体实验步骤如下： 1)生物信息学分析融合方式P-exon 6:T-exon 13编码的ORF 根据之前鉴定的RNA融合位点，发明人推测出融合基因转录本全长，利用DNA start 软件(可选用其他软件）的edit seq模块，预测得到编码蛋白的0RF。
[0046] 2) PCR扩增全长0RF，并克隆到pRetroX-Tight-Pur表达载体 发明人针对以上预测0RF，设计克隆引物，PCR扩增，因没有特异性识别此融合蛋白的 抗体，因此在融合蛋白N端带上flag标签 (1)引物设计与合成（Invitrogen公司） PLEKHAl-TACC2-full length-sense :5'-CGGGATCCATGGATTACAAGGATGAC (SEQ ID NO: 11) 5'-GACGATAAGATGCCTTATGTGGATCGTCAGAA-3' （SEQ ID N0:12) PLEKHAl-TACC2-full length-antisense :5'-GGAATTCTTAGCTTTTCCCCATTT (SEQ ID NO ：13) TGGC-3， (2) PCR扩增 采用Takara公司的primer start高保真DNA聚合酶，模板是包含该融合方式的食管 癌标本cDNA，反应体系如下：
(3) 琼脂糖电泳以及胶回收 配置1%琼脂糖胶 Ig 琼脂糖粉 100ml IXTAE电泳缓冲液 胶回收用的是天根公司的胶回收试剂盒（DP209)，并按照说明书操作。
[0047] (4)胶回收的PCR以及pCDNA3. 1 ( + )空载体酶切 50 μ 1酶切体系配置：
37°C孵育30min以上； (5)琼脂糖电泳及胶回收，步骤同上，其中回收产物用20μ1 CldH2O洗脱，空载用50 μ 1 CldH2O 洗脱。
[0048] ⑶连接
15 μ 1连接体系 16°C连接30min以上。
[0049] (7)连接产物转化 根据天根公司的DH5 α感受态细胞（CBlOl)转化步骤进行。
[0050] (8)挑单克隆 10 μ 1枪头挑至少2个菌落至含100ng/ml氨苄抗生素的LB培养基，37 °C摇床培养 12-20h。
[0051] (9)小提质粒 按照天根公司小提质粒的试剂盒说明书的步骤进行。
[0052] (10)酶切鉴定 酶切体系同上。
[0053] (11)琼脂糖电泳，目的片段大小判断； (12) 鉴定正确的质粒送测序，鉴定没有突变； (13) 质粒大量提纯： 测序鉴定没有突变的质粒，需要经行质粒的大量提取，本发明人所在实验室采用氯化 铯密度梯度离心法。
[0054] (14)磷酸钙转染和磷酸钙包装逆转录病毒 a) 提前一天铺293FT细胞，因为细胞贴壁不牢，培养皿需要用明胶预先处理：在IOcm 培养板中加2-3ml 0. 1%的明胶覆盖培养皿底部在37度放置至少15min ; b) 消化293FT细胞，吸走培养皿中的明胶，IOcm培养皿铺1-1. 2xl06细胞数，放培养箱 内培养 c) 24h后，待细胞密度达40%左右时，进行磷酸钙转染： 加反应体系： I. 目的质粒稀释至lug/ul，病毒包装质粒PIK也稀释至lug/ul; II. 取1.5ml离心管，每管加20-25ul目的质粒，然后加等量PIK ; III. 加 IOOul超纯水； IV. 加 50 ul IM 的 CaCl2 ; V. 加200ul HBS (PH=6. 75)，缓慢逐滴加入，混匀。
[0055] d) EP管在室温下静置15-30 min ; e) 将待转染的293FT细胞取出，吸走部分培养基，是剩下的培养基4-5ml ; f) 将待转染的质粒（DNA-磷酸钙沉淀）均匀滴入转染细胞培养皿，轻轻摇动使混匀； g) 每培养皿中加40 ul氯喹（终浓度25uM)，轻轻混匀； h) 37度，5% CO2培养箱中培养6小时； i) 6小时候后，从培养箱中取出细胞，小心吸去培养基； j) 用Ix的solution A洗细胞两次，轻轻摇晃，至沉淀全部溶解； k) 培养皿加入含10% FBS的新鲜培养基6. 5ml在37度，5% CO2培养箱中培养。
[0056] (15)病毒收集和细胞感染 a) 18小时后，开始收集病毒，每4小时收集一次，用注射器吸取培养皿上清，0. 45um过 滤器进行过滤。病毒液可以直接用于感染细胞； b) 病毒液也可以保存于病毒冻存管中，-80度保存。
[0057] 2 X HBS (PH=6. 75)： 50mmol/L HEPES, 130mmol/L NaCl, I. 5mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4调 ΡΗ=6· 75 过滤后分装4度保存 lmol/L CaCl2:Illg CaCl2溶于900ml水中，搅拌溶解，定容至1000ml，过滤。
[0058] (16)建立稳定细胞株 病毒2天内感染3次后，加入含抗生素 puromycin (2ug/ml)、G418 (400ug/ul)以及 Dox (200ng/ml)培养基培养2周，注意每隔两天换液，待细胞生长正常后收取蛋白和RNA 用于鉴定。
[0059] (17) MTT assay a) 消化细胞并计数； b) 取200 μ 1细胞悬液含2000 cell加入96孔板内，每组设6个平行的复孔，连续测 6天； c) 5% C02、37°C培养； d) 实验中止前4h加入5mg/ml MTT液20 μ 1，继续培养4h ; e) 弃去培养液，每孔加入200 μ I DMS0,37°C 10分钟，待结晶溶解后在酶联检测仪上检 测490nm波长下每孔的OD值； f) 待6天检测完后，利用每天的OD值做生长曲线。
[0060] (18)Western Blot,检测融合蛋白表达情况 a)细胞蛋白样品的提取 收集状态较好的细胞，弃去培养液，用PBS洗涤两次，洗净残余的培养基。弃去PBS，根 据细胞的数量加入适当的IXsample buffer,在冰上裂解IOmin后用细胞刮将粘稠的细胞 裂解产物刮下，收集到I. 5ml的EP管中，用Iml的无菌一次性注射器对裂解产物反复抽吸， 抽吸到裂解产物变成清澈的水滴状物质。12000rpm离心5min，若有沉淀则吸取上清到新的 EP管中，弃去沉淀。放在冰上待测浓度，分装后-20°C短暂保存，-80°C可长期保存，避免反 复冻融。
[0061] b)蛋白定量 根据BCA蛋白定量试剂盒说明书，计算出所需的BCA工作液的总量，96孔板每孔加入 200 μ 1工作液，配制BCA工作液的比例为A液：B液=50 :1。首先在每200 μ I BCA工作液 中加入5μ1 PBS，然后按浓度从小到大的顺序加入5μ1标准液，再在后面的孔中加入样品 蛋白，记好顺序和编号，放入37°C恒温箱中孵育30min。用酶标仪在波长562nm测定吸光光 度，并换算成蛋白浓度。
[0062] c)配胶 根据上样量选择I. 5_的配胶玻璃板和孔梳，洗干净后，组装好玻璃板后，加入去离子 水以检测有无漏水，若是5min后水面无明显下降即可定为无渗漏现象。用吸水纸吸出玻璃 板中的水，配置10. 5%的SDS聚丙烯酰胺下层胶(分离胶)，迅速加入玻璃板至距薄玻璃板上 缘约I. 5-2cm的位置(尽量避免产生气泡)，立刻加入无水乙醇封胶。待下层胶凝固后，用吸 水纸吸去无水乙醇，配置上层胶（浓缩胶），配好后迅速加入玻璃板中，插入孔梳(避免有气 泡)。配好的胶可以放入4°C过夜次日使用，但是最好是现配现用。
[0063] d)蛋白变性与配平 100 μ 1样品加入5 μ 1的已混入少量溴酚蓝β-巯基乙醇，混匀，短暂离心后放入加热 仪中98°C变性lOmin，变性好的蛋白放在冰上避免降解。根据蛋白浓度计算出上样量30 μ g 所需蛋白体积，用上样缓冲液配至相同体积。
[0064] e)上样与电泳 组装好电泳装置后，向槽内的玻璃板中缓慢倒入IXrunning buffer直至液面与玻璃 板齐平，确定无液体漏出后，向外槽也加入适量的IXrunning buffer。用10 μ 1移液器分 别缓慢加入样品液，和蛋白Marker，注意避免样品从孔中溢出。正确连接导线，接通电源， 先用60V恒压电泳，待样品泳入下层胶(分离胶)后，根据目的条带的大小（PTK6条带大小约 55左右)，将电压调制100V，直到看见蓝色的溴酚蓝条带移到玻璃板底端，可关闭电源停止 电泳。
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