一种苦参碱抑制人胰腺癌细胞迁移的分析方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及苦参碱抑制人胰腺癌细胞迀移的分析方法的技术领域。
【背景技术】
[0002]苦参碱是一种从苦参等豆科植物中提取出来的生物碱，被广泛应用于抗菌、抗病毒治疗中。近几年的研宄发现，苦参碱能显著抑制肿瘤细胞增殖。临床工作中苦参碱已经用于宫颈癌及白血病的治疗。深入探讨苦参碱药理及生物学机制对于开发苦参碱临床应用具有重要意义。fct信号通路不仅在机体正常发育中具有重要作用，而且在肿瘤发生发展中也具有重要作用。研宄发现在多种肿瘤的发生及进展中均存在fct通路的异常活化。现在研宄认为fct/PCP通路与一些细胞极化、迀移及转移相关的分子结合，在调节细胞迀移及浸润中发挥重要作用。β -catenin是Wnt信号通路中重要的调节介质，Wnt通路活化后，β -catenin进入细胞核内调节Wnt革巴基因的转录。在细胞核内β -catenin与Tcf_4形成复合体，调节MTl-MMP的转录，进而调节细胞迀移与浸润。在前期研宄中，我们发现苦参碱能抑制肿瘤细胞迀移、浸润及转移。但具体机制不明。苦参碱抑制肿瘤细胞迀移是否与调节Wnt通路活性有关，值得进一步深入探讨。
【发明内容】
[0003]本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种苦参碱抑制人胰腺癌细胞迀移的分析方法，采用该方法分析后能得知苦参碱作用一定时间能显著降低人胰腺癌细胞的迀移与浸润能力，人胰腺癌细胞迀移相关蛋白MTl-MMP及Wnt、β -Catenin表达明显降低；进一步检测发现MTl-MMP转录活性也显著降低，与Wnt信号通路活性一致，苦参碱通过调节Wnt通路活性，降低MTl-MMP的转录与表达，进而抑制人胰腺癌细胞的迀移与浸润。
[0004]为实现上述目的，本发明提出了一种苦参碱抑制人胰腺癌细胞迀移的分析方法，其特征在于:依次包括以下步骤:
a)人胰腺癌细胞培养:将人胰腺癌细胞培养于RPM1-1640培养基中，RPM1-1640培养基中含胎牛血清、生物活性为100 IU/mL的青霉素和生物活性为100 Pg/mL的链霉素，RPM1-1640培养基培养于37° C，CO2体积浓度为5%培养箱中；
b)单层细胞迀移分析:将人胰腺癌细胞接种于6孔板中培养24h，当人胰腺癌细胞汇合度达90%以上时，用200 μ I无菌Tip枪头固定一个角度进行划痕，然后使用无菌PBS洗去人胰腺癌细胞碎片，再加入新鲜的RPM1-1640培养基，其中一组不加入苦参碱作为空白组，药物处理组分别加入浓度为25 μ g/ml、50 μ g/ml苦参碱作用24_48h，最后通过倒置相差显微镜跟拍摄细胞迁移能力；
c)细胞浸润分析:将处于对数生长期的人胰腺癌细胞按4X 14密度接种于细胞浸润小室，细胞浸润小室上部为含有2% FBS的的RPM1-1640完全培养基，细胞浸润小室下部为含有10% FBS的RPM1-1640完全培养基，人胰腺癌细胞在培养箱中孵育2h后，分别加入浓度为0μ/πι1、25μ/πι1、50μ/πι1的苦参碱处理并在培养箱中孵育10h，然后加入多聚甲醛室温固定15min，使用无菌PBS洗三次后加入0.2%结晶紫染lOmin，去离子水冲洗干净后置于倒置显微镜下拍照计数，实验重复三次进行统计分析；
d)酶联免疫吸附分析:将处于对数生长期的人胰腺癌细胞按4X14密度接种于6孔板培养过夜后，分别加入浓度为O μ g/ml、25 μ g/ml、50 μ g/ml的苦参碱处理并在培养箱中孵育24h，将人胰腺癌细胞进行裂解处理，收集人胰腺癌细胞上清液，分别采用MMP-9 ELISA试剂盒、MMP-2 ELISA试剂盒来检测不同实验组中MMP-9和MMP-2的浓度；
e)免疫印迹分析:收集人胰腺癌细胞加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂Cocktail，细胞裂解液由 50 mM Tris (pH 7.4)，150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1% sodiumdeoxycholate, 5mM EDTA, 100 mM NaF, ImM Na3V04组成，在冰浴中裂解 30min，离心机离心30min后收集上清，通过BCA法测蛋白浓度并均衡各组蛋白，同等量细胞总蛋白用于12%SDS-PAGE电泳，蛋白经湿转法转到PVDF膜，室温下添加5%脱脂奶粉后封闭lh，然后加入兔抗人wnt、β -catenin、MT 1-MMP,在4°C的温度下孵育过夜，采用PBST缓冲液洗三次，加入HRP标记的山羊抗兔二抗，室温孵育Ih，PBST缓冲液洗三次后，加入ECL超敏发光液，将PVDF膜进行压片、曝光、显影及定影，图像经Image J软件灰度扫描后进行统计分析。
[0005]本发明的有益效果:采用该方法分析后能得知苦参碱作用一定时间能显著降低人胰腺癌细胞的迀移与浸润能力，人胰腺癌细胞迀移相关蛋白MTl-MMP及Wnt、β -Catenin表达明显降低；进一步检测发现MTl-MMP转录活性也显著降低，与Wnt信号通路活性一致，苦参碱通过调节fct通路活性，降低MTl-MMP的转录与表达，进而抑制人胰腺癌细胞的迀移与浸润。
【具体实施方式】
[0006]本发明一种苦参碱抑制人胰腺癌细胞迀移的分析方法，其特征在于:依次包括以下步骤:
a)人胰腺癌细胞培养:将人胰腺癌细胞培养于RPM1-1640培养基中，RPM1-1640培养基中含胎牛血清、生物活性为100 IU/mL的青霉素和生物活性为100 Pg/mL的链霉素，RPM1-1640培养基培养于37° C，CO2体积浓度为5%培养箱中；
b)单层细胞迀移分析:将人胰腺癌细胞接种于6孔板中培养24h，当人胰腺癌细胞汇合度达90%以上时，用200 μ I无菌Tip枪头固定一个角度进行划痕，然后使用无菌PBS洗去人胰腺癌细胞碎片，再加入新鲜的RPM1-1640培养基，其中一组不加入苦参碱作为空白组，药物处理组分别加入浓度为25 μ g/ml、50 μ g/ml苦参碱作用24_48h，最后通过倒置相差显微镜跟拍摄细胞迁移能力；
c)细胞浸润分析:将处于对数生长期的人胰腺癌细胞按4X 14密度接种于细胞浸润小室，细胞浸润小室上部为含有2% FBS的的RPM1-1640完全培养基，细胞浸润小室下部为含有10% FBS的RPM1-1640完全培养基，人胰腺癌细胞在培养箱中孵育2h后，分别加入浓度为0μ/πι1、25μ/πι1、50μ/πι1的苦参碱处理并在培养箱中孵育10h，然后加入多聚甲醛室温固定15min，使用无菌PBS洗三次后加入0.2%结晶紫染lOmin，去离子水冲洗干净后置于倒置显微镜下拍照计数，实验重复三次进行统计分析；
d)酶联免疫吸附分析:将处于对数生长期的人胰腺癌细胞按4X14密度接种于6孔板培养过夜后，分别加入浓度为O μ g/ml、25 μ g/ml、50 μ g/ml的苦参碱处理并在培养箱中孵育24h，将人胰腺癌细胞进行裂解处理，收集人胰腺癌细胞上清液，分别采用MMP-9 ELISA试剂盒、MMP-2 ELISA试剂盒来检测不同实验组中MMP-9和MMP-2的浓度；
e)免疫印迹分析:收集人胰腺癌细胞加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂Cocktail，在冰浴中裂解30min，离心机离心30min后收集上清，通过BCA法测蛋白浓度并均衡各组蛋白，同等量细胞总蛋白用于12% SDS-PAGE电泳，蛋白经湿转法转到PVDF膜，PVDF膜上室温下添加5%脱脂奶粉后封闭lh，然后加入兔抗人wnt、β -catenin,MTl-MMP,在4°C的温度下孵育过夜，采