专利名称：用于诊断膀胱肿瘤的蛋白芯片及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种医学检测试剂，特别是一种以受检者尿液为样本，检测受检者是
否可能患有膀胱肿瘤的蛋白芯片，以及这种芯片的制备方法。更为确切讲本发明是一种采
用免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)，是以胶体金作为示踪标志物应 用于膀胱肿瘤的免疫标记试剂。
背景技术：
肿瘤的发生是多个基因和蛋白发生改变的结果，多认为多指标肿瘤标志物联合检 测可以弥补单项指标检测的不足，从而提高诊断的准确性。我国在1997年开始立项对生 物芯片技术的研究，近年来发展十分迅猛，目前已取得巨大的进展，且已在生命科学领域中 发挥作用。蛋白质芯片的出现为提高肿瘤的诊断水平提供了技术基础，具有高通量、高灵敏 度、高特异性和微量化的优点。国内外虽已投入了大量的资金进行实验，但目前尚无膀胱癌 诊断相关蛋白芯片产品问世。另据报道，美国FDA至今尚未通过一项用于膀胱肿瘤的蛋白 芯片产品认证许可。 膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的20%。男女发病比例 约为4 : 1，60岁以后发病率增高，近年来发病呈年轻化趋势，浅表性膀胱癌占70%以上，且 术后复发率高，初次治疗后复发率高达50% 70%。因此要求患者定期随访，平均每1 3月需复查一次膀胱镜，使患者非常痛苦。据测算平均每年每个膀胱癌患者的医疗费高达 数万元，再加上患者丧失劳动力，直接威胁着国民的健康，给经济和社会发展造成了严重的 损失。膀胱癌的分期分级不同其相应的预后亦极不相同，若早期发现并及时予以治疗，患者 可获得很高的5年生存率，甚至完全得到治愈。在目前使用的诊断方法中，膀胱镜检查和尿 脱落细胞学检查是膀胱癌诊断的金标准，但是膀胱镜毕竟是一种侵入性检查，患者较为痛 苦，接受性差。同时对膀胱顶部及膀胱前壁的肿瘤有时不易发现，且尿道狭窄患者无法行膀 胱镜检查；尿脱落细胞学虽为无创的诊断方法，但阳性率受多种因素的影响，其敏感性只有 18. 4% 62. 0%，其效果远远不能令人满意。目前尚无针对膀胱癌简便易行可靠的早期筛 查和诊断方法。因此，探索新的无创诊断方法，提高膀胱肿瘤的诊断水平、尤其是早期诊断 水平，显得尤为迫切，而且具有良好的经济效益及社会效益，并且有很好的市场前景。
发明内容
本发明提供一种受检者尿液为样本，检测受检者是否患有膀胱肿瘤的蛋白芯片。
本发明的诊断膀胱肿瘤的蛋白芯片由下述物质组成a.在固相载体上包被有 Survivin抗原蛋白、纤维粘连抗原蛋白Fibronectin，以及基质核金属蛋白酶9即匪P9三 种肿瘤标志物的单克隆抗体；b.在封闭容器内贮藏的偶联于胶体金上的Survivin抗体、 Fibronectin抗体及匪P9抗体。 本发明的诊断膀胱肿瘤的蛋白芯片中，在固相载体上包被以1% BSA稀释的三种 肿瘤标志物Survivin蛋白、纤维粘连蛋白、基质核金属蛋白酶9的单克隆抗体，三者之间按1:1: 2的比例包被，其相对量为分别为lOii g/ml、10ii g/ml、20ii g/ml。
本发明的诊断膀胱肿瘤的蛋白芯片的制备方法为
a.制备标记抗体所用的胶体金；b.用已制备好的胶体金标记Survivin抗体、Fibronectin抗体及匪P9抗原，并将 标记后的胶体金溶于胶体金保存液中，再将其置于密封容器内保存。
c.制备用于包被三种瘤标的硝酸纤维素膜固相载体； d.将三种肿瘤标志物分别包被于固相载体上。将Survivin蛋白、纤维粘连蛋白、 基质核金属蛋白酶9的单克隆抗体以1% BSA稀释好，室温平衡30min后，用微阵列打点机 点样于硝酸纤维素膜上。 肿瘤标志物是由肿瘤细胞所产生，存在于组织或体液中，反映肿瘤存在和生长的 一类物质。膀胱与外界相通，检测尿液中的肿瘤标志，易于操作，患者容易接受，且方便进行 大规模普查。虽然近年来，一些单项肿瘤标志物指标被许多学者所重视并得到研究，已获得 一些进展，但因其单独应用受到假阳性率或假阴性率较高的干扰，不能满意地解决临床诊 断中所要求较高的敏感度和高的特异度指标，这限制了其应用。因此联合检测多个肿瘤标 志物来提高诊断的准确性则显得尤为重要。 相应的实验结果显示尿液中Survivin蛋白诊断膀胱癌的敏感性为95X，特异性 为93% ;尿液中Fibronectin诊断浸润性膀胱移行上皮癌的灵敏度为76. 47% 100%， 特异度为87. 22%，诊断正确率仅为86. 96% ;E。虽然NUTT实验发现匪P-9在高分期膀胱 癌中明显增高，主要降解IV型胶原、明胶和纤维粘连蛋白，因此匪P9对肿瘤细胞浸润和转 移至关重要。临床实验表明匪P9高表达患者的预后与低表达患者的预后有显著的差异， 故匪P9更是判断浸润性膀胱移行上皮癌预后的重要指标。通过ELISA法分别检测了以上 三种肿瘤标志物在膀胱癌患者和健康人群尿液中的含量，结果显示联合检测三种肿瘤标志 物进行临床诊断可使其检测灵敏度显著增高，而诊断的符合率可上升20%。这些结果为将 Survivin、 Fibronectin、和MMP-9联合应用研发诊断性蛋白芯片诊断膀胱癌提供了科学依 据。而且实验还表明将前述的三种肿瘤标志物联合检测，其诊断准确性明显高于单独一种 标志物的检测组合。
具体实施例方式以下提供
具体实施例方式
本发明的诊断性蛋白芯片的检测原理为双抗夹心法。具体操作过程为
1、制备胶体金。①用50ml量筒量取35ml的1X柠檬酸三钠预热至6(TC ;②用 1000ml量筒量取975ml去离子水，加入圆底烧瓶中；③用25ml量筒量取25ml的1%氯金 酸加入盛水的圆底烧瓶中并摇匀，加入时注意勿沾内壁；④将烧瓶在电热套中加热，直到 沸腾并持续lmin ;⑤在摇晃烧瓶时将预热的柠檬酸三钠迅速加入烧瓶，加入时注意勿沾内 壁；⑥加快摇晃的速度，使氯金酸与柠檬酸三钠充分反应，液体金黄色变为黑色，再变为酒 红色，持续加热10min ;⑦10min后关闭电源，将烧瓶取出盖上玻璃皿降温；⑧直到温度降至 室温，测其0D值；⑨测的最大波长必须在526士2nm。 2、包被抗体。硝酸纤维素膜上分区包被Survivin、Fibronectin、和匪P-9(用1% BSA稀释)的单克隆抗体，其抗体相对量分别为10ii g/ml、10ii g/ml、20ii g/ml。
3、制作金标抗体。①将制备的裸金分装，200ml/瓶，放入冰水浴；②调ffl值，每瓶 加入0. 1M K2C03约8ml，摇匀；③配制lmg/ml的抗体每瓶加1. 2ml，滴加二抗每次加0. 6ml， 边加边摇，摇动时不要起泡，滴加速度约为5 10滴/分钟，滴加完后放置30min ; 加入 已配好并过滤的10X的BSA 20ml/瓶，1滴/秒，边加边摇，放置5min ;⑤加入1X的PEG， 40ml/瓶，1滴/秒，边加边摇，放置5min，过夜。 4、点样。将受检者的尿液点样，待完全渗入后；加1滴PBST洗涤液，使之与包被在 硝酸纤维素膜上的Survivin、 Fibronectin、和匪P-9单抗特异结合，形成抗原抗_体复合 物。 5、滴加金标抗体。加入数滴经胶体金标记过的Survivin、 Fibronectin、和匪P-9
单克隆抗体，待渗完90秒后，加1滴PBST洗涤液，与以上抗原抗-体复合物特异结合，完成
对标本中抗原_抗体复合物的金染色。 6、芯片阅读仪扫描反应后的芯片，记录灰度值。 检测实例 分别取正常人尿样和已经证实患有膀胱癌病人的尿样各五份，分为对照组和实验 组。严格按照上述步骤操作，进行对比和验证本蛋白芯片的检测结果。结果发现，在蛋白芯 片上，以正常人尿液为样品检测的反应点，即对照点的色度没有变化；而以膀胱癌患者尿液 为样品检测的反应点，其色度明显浓于对照点，参见表1 。
表1不同尿样浓度的灰度值比较
对照组实验组试样编号检测灰度值试样编号检测灰度值
17.30611.080
26.51321.051
36.49231.040
46.53341.018
57.72351.011 实验还发现，各个反应点之间的色度也因尿液中三种蛋白的含量高低不同而深浅 不同，且检测样品的灰度值随着被检样品三种蛋白浓度的增加而呈现良好的递增关系，表 现出样品浓度对其相应芯片阅读仪扫描值的相关型曲线，说明芯片阅读仪扫描结果值随着 不同浓度样品的增加而增加，且有着良好的相关性。而且实验还表明将前述的三种肿瘤标 志物联合检测，其诊断准确性明显高于单独一种标志物的检测组合。
权利要求
诊断膀胱肿瘤的蛋白芯片，其特征是该芯片至少由下述物质组成a.在固相载体上包被有Survivin抗原蛋白、纤维粘连抗原蛋白Fibronectin，以及基质核金属蛋白酶9即MMP9三种肿瘤标志物的单克隆抗体；b.在封闭容器内贮藏的偶联于胶体金上的Survivin抗体、Fibronectin抗体及MMP9抗体。
2. 权利要求1所述的诊断膀胱肿瘤的蛋白芯片，其特征是固相载体上包被以1% BSA 稀释的三种肿瘤标志物Survivin蛋白、纤维粘连蛋白、基质核金属蛋白酶9的单克隆抗体 的相对量为分别为1:1:2。
3. 权利要求1或2所述的诊断膀胱肿瘤的蛋白芯片的制备方法，其特征是a. 制备标记抗体所用的胶体金；b. 用已制备好的胶体金标记Survivin抗体、Fibronectin抗体及匪P9抗原，并将标记 后的胶体金溶于胶体金保存液中，再将其置于密封容器内保存。c. 制备用于包被三种瘤标的硝酸纤维素膜固相载体；d. 将三种肿瘤标志物包被于固相载体上。将Survivin蛋白、纤维粘连蛋白、基质核金 属蛋白酶9的单克隆抗体以1% BSA稀释好，室温平衡30min后，用微阵列打点机点样于硝酸纤维素膜上。
全文摘要
本发明公开一种以受检者尿液为样本，检测受检者是否可能患有膀胱肿瘤的蛋白芯片，以及这种芯片的制备方法。本发明的芯片至少由下述物质组成a.在固相载体上包被有Survivin抗原蛋白、纤维粘连抗原蛋白Fibronectin，以及基质核金属蛋白酶9即MMP9三种肿瘤标志物的单克隆抗体；b.在封闭容器内贮藏的偶联于胶体金上的Survivin抗体、Fibronectin抗体及MMP9抗体。
文档编号G01N33/68GK101718792SQ20091026055
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月10日 优先权日2009年12月10日
发明者王志平 申请人:兰州大学