用于治疗血液肿瘤的抗IL-3Rα抗体的制作方法
【专利说明】用于治疗血液肿瘤的抗IL-3Ra抗体
[0001] 本申请是国际申请日2010年4月27日、国际申请号PCT/JP2010/057510于2011 年12月20日进入中国国家阶段、申请号201080027383. 1、发明名称"用于治疗血液肿瘤的 抗IL-3RA抗体"的申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及针对人类IL-3Ra蛋白（另一个名称：人类⑶123)的抗体。本发明还 涉及用于髓细胞恶性肿瘤、特别是急性骨髓性白血病（AML)的治疗药剂和诊断药剂，其包 含人类IL-3Ra抗体作为活性成分的发明。
[0003] 发明背景
[0004] 关于恶性肿瘤：
[0005] 在日本，恶性肿瘤（癌症）是死亡的第一主导原因，患者的数量每年增加，极其需 要开发具有高的效能和安全性的药物和治疗方法。作为形成恶性肿瘤的原因，存在着由辐 射、紫外线和各种致癌物质引起的DNA突变。关于恶性肿瘤的研究集中于通过分子生物学 鉴定这些遗传变化。结果，认为致瘤性转化由大量突变的积累等诱导。通过细胞系模型等 已经显示，某些决定性突变与致瘤性转化直接相关。关于作为本发明的目标疾病之一的白 血病，已经鉴定并分类了许多染色体畸变。在许多病例中发现了染色体易位，并且在主要的 染色体易位中已经鉴定了与染色体易位相关的一些基因。通过分析易位相关基因的功能发 现了一种情况，即这些基因与白血病的发生相关。
[0006] 关于癌症干细胞：
[0007] 另一方面，长时间以来，从细胞生物学观点提出了所谓的癌症干细胞假说，其主张 与正常组织类似，恶性肿瘤同样起源于干细胞。干细胞被定义为具有自主复制能力和多能 性的细胞，并粗略分成全能干细胞和组织干细胞。组织干细胞源自于特定组织和器官例如 血液系统、肝脏、神经系统等，并以极低频率存在。其中，造血干细胞研究得最频繁。已报道， 通过将一个造血干细胞移植到造血系统被致死剂量的辐射所破坏的小鼠中，可以在长时间 内重建造血系统（非专利文献1)。与正常干细胞不同，关于癌症干细胞的研究已经延迟了 很长时间，因为不能发现它们的真正本质。然而，在1997年由Dick等首次在急性骨髓性白 血病中鉴定到癌症干细胞。此后，已经在各种恶性肿瘤中报道了癌症干细胞的存在。概括 来说，癌症干细胞以全部肿瘤的百分之几或更低的频率存在，并且与正常干细胞同样稀少。 据认为，形成肿瘤的其余细胞是增殖能力有限的肿瘤前体细胞或肿瘤细胞。
[0008] 通过这些报告，显示了即使是在肿瘤中也存在与正常组织类似的层次结构，并且 位于其顶点（源点）的癌症干细胞具有强的肿瘤形成能力。
[0009] 癌症干细胞的特征和治疗问题：
[0010] 总结许多报告，认为癌症干细胞维持了正常干细胞所具有的各种特征。相似性的 实例包括细胞的稀少性、细胞存在于其中的微环境（生境）、多药物抗性基因的表达、细胞 周期阻滞等。
[0011] 具体来说，它们表达一组多药物抗性基因并且与正常干细胞类似处于细胞周期间 期的特征，可能变成治疗上的极大问题。多药物抗性基因BCRP是通过将各种抗肿瘤药剂排 除到细胞外部而损害药物效能的泵，并且已经报道了一种利用这种活性收集干细胞的方法 (非专利文献2)。此外，它们在细胞周期间期在"冬眠"状态下存在（非专利文献3)，引起 对靶向癌症细胞快速生长的许多抗肿瘤药剂以及辐照敏感性的降低（非专利文献4和5)。
[0012] 根据上述特征，认为对治疗表现出抗性的癌症干细胞是肿瘤再生的原因。
[0013] 关于分子定向药物
[0014] 恶性肿瘤治疗的三个主要过程包括抗肿瘤药剂治疗、放射治疗和手术切除。血液 肿瘤仅限于抗肿瘤药剂治疗和放射治疗，并且如上所述，癌症干细胞可能对这些治疗具有 抗性。另一个问题是由于这两种治疗影响整个身体，因此副作用大。预期分子定向药物将 作为这个问题的解决手段。它能够通过只在表达靶分子的细胞中表现出其药效来降低副作 用。
[0015] 在血液病领域中分子定向药物的典型药物实例包括伊马替尼和利妥昔单抗。伊 马替尼靶向由在95%的CML患者中观察到的染色体畸变（费城染色体）所产生的被称为 Bcr-Abl的引起白血病的因子。这是一种低分子量药物，其通过抑制Bcr-Abl的功能诱导白 血病细胞自杀。利妥昔单抗是治疗性抗体，其识别B细胞上的表面分子CD20,并对B细胞的 恶性肿瘤（非霍奇金淋巴瘤等）具有抗肿瘤效应。另一方面，用于AML的分子定向药物很 少，只有药剂吉妥珠单抗-奥唑米星（Mylotarg)，其中将抗生素calicheamicin与针对已知 AML细胞表面抗原⑶33的单克隆抗体相连。然而，目前的形势是Mylotarg的使用受限，这 是因为据认为源自于calicheamicin的强烈毒性，以及治疗范围狭窄的问题。基于上述，可 以说发现新的靶基因并开发用于它的治疗药剂将是重要的发明，其直接导致治疗的可能性 并扩展了治疗的选择范围。
[0016] 作为分子定向药物的实施方案，已经研究并开发了各种物质，例如治疗性抗体和 低分子量药物，以及肽类药物、生物蛋白制剂例如细胞因子、siRNA、适体（aptamer)等。当 抗体被用作治疗药剂时，由于其特异性，它可用于治疗其中患病细胞表达特定抗原的病理 状况。抗体与作为其抗原在细胞表面上表达的蛋白结合，并有效地作用于被结合细胞。抗 体具有长的血液半衰期和对其抗原的高特异性的特征，并且也可显著用作抗肿瘤药剂。例 如，当抗体靶向肿瘤特异性抗原时，可以预计给药的抗体积累在肿瘤中，从而通过补体依赖 性细胞毒性（CDC)和抗体依赖性细胞毒性（ADCC)攻击肿瘤细胞。此外，通过将放射活性 物质、细胞毒性物质等与抗体结合，有可能将药剂有效转移到肿瘤部分并因此允许在其上 发挥作用。同时，它能够降低药剂到达其他非特异性组织的量，并且也可以预期副作用的降 低。当肿瘤特异性抗原具有诱导细胞死亡的活性时通过给药具有激动活性的抗体，或者当 肿瘤特异性抗原与细胞生长和存活有关时通过给药具有中和活性的抗体，预期可以抑制肿 瘤生长或使肿瘤退行。由于上述特征，因此认为抗体适合用作抗肿瘤药剂。
[0017]关于治疗性抗体：
[0018] 在原始抗体制备中，使用小鼠作为待免疫动物。然而，由于大量原因，使用小鼠抗 体作为药物受到限制。在人体中可以被识别为外来物质的小鼠抗体，可以诱导所谓的"人类 抗小鼠抗体"、即"HAMA"应答（非专利文献6)。此外，小鼠抗体的Fc区不能通过人类补体 或人类免疫细胞有效攻击患病细胞。
[0019] 作为用于避免这样的问题的方法之一，开发了嵌合抗体（专利文献1和2)。嵌合 抗体含有源自于两种或更多物种的抗体部分（小鼠抗体可变区、人类抗体恒定区等）。这种 嵌合抗体的优点在于它保持了小鼠抗体的特征，但是可以活化人类补体或人类免疫细胞， 因为它具有人类Fc。然而，已知这样的嵌合抗体仍然诱导"人类抗嵌合抗体"、即"HACA"应 答（非专利文献7)。
[0020] 此外，已经开发了重组抗体，其中抗体唯一被取代的部分是互补性决定区（"⑶R"） (专利文献3和4)。通过使用⑶R嫁接技术，制备了包含小鼠⑶R和人类可变区构架和人 类恒定区的抗体，即所谓的"人源化抗体"（非专利文献8)。此外，通过使用产人类抗体的 小鼠或通过使用人类抗体文库进行筛选，已经提供了可用于制备完全人类抗体的广泛应用 的技术（非专利文献9和10)。
[0021]关于IL-3Ra:
[0022] IL-3Ra是IL-3受体的a链，属于细胞因子受体家族，并对作为其配体的IL-3显 示出弱亲和性。通过与其P链（⑶131，在后文中也称为IL-3RP)形成异源受体，IL-3受体 具有强的结合性，并通过P链的细胞内区域将信号例如生长、分化等传递到细胞中。IL-5 受体a链和GM-CSF受体a链享有共同的0链。
[0023]IL-3Ra是单次通过的跨膜I型膜蛋白，并且根据序列了解到在膜外区域中存在 IL-3结合位点和III型纤连蛋白位点。已知不存在能够在膜内区域中传递信号的结构。 尽管IL-3Ra的三维结构还没有被分析，但可以推测家族之间细胞因子受体的结构是相似 的，因为在大多数情况下形成结构上重要的S-S键的半胱氨酸残基的位置得以保留。在同 样的细胞因子受体中，IL-13受体a链、IL-4受体a链和GM-CSF受体a链的晶体结构已 被分析。根据这些细胞因子受体家族的信息，可以推测IL-3Ra的膜外区域粗略分成3个 结构域（A-B-C结构域）。已知识别人类IL-3Ra的A结构域的抗体7G3阻断IL-3信号传 导（非专利文献11)。此外，已经报道了缺少A结构域的IL-3Ra分子的表达（非专利文献 12)，并且当然识别A结构域的抗体不能识别缺少A结构域的IL-3Ra。此外，