一种用于检测丙型肝炎病毒时作为阳性对照的双功能抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及酶联免疫试剂盒，具体地说，涉及一种用于检测丙型肝炎病毒时作为 阳性对照的双功能抗体及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 丙型病毒性肝炎（hepatitisC)是一种主要经血液传播的疾病，由丙型肝炎病毒 (hepatitisCvirus，HCV)感染引起，呈全球性流行，感染率约3%。我国一般人群感染率 为3. 2%，长江以北为3. 6%，中南和东北地区分别高达3. 8%和4. 6%。
[0003] 丙型肝炎的危害在于HCV感染后自发痊愈病例极少，慢性化率可高达60 %? 85%。其后果是导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，容易转化为肝硬化、肝细胞癌（HCC)等终 末期肝病，预后差。我国十五科技攻关的资料表明，感染10年和20年以上的肝硬化发生率 分别为9. 20%和15. 29%。世界卫生组织（WHO)对6个国家的11项研宄资料表明，感染20 年后平均肝硬化发生率为10%?15%，最高可达55%，而HCC的发生率最高可达23%。由 于其流行的广泛性和致病后果，与乙肝一起，被专家称为比艾滋病还要严重的疾病。
[0004] HCV属于黄病毒科（fIaviviridae)，其基因组为单股正链RNA，易变异，可分为6个 基因型及11种以上不同亚型。HCV进入人体后，与宿主染色体整合，宿主可以重复感染不同 的基因型或亚型。HCV目前尚不能用常规方法培养，也没有疫苗和特效药物，控制其流行以 预防为主。
[0005] 鉴于丙型肝炎对人民健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题， 我国卫生部和中华医学会于2004年3月推出了《丙型肝炎防治指南》，几乎同时，美国也发 布了《丙型肝炎诊断处理和治疗指南》。
[0006] 《指南》指出目前国内外广泛使用的主流试剂是第三代抗-HCV酶联免疫检测试剂， 其基本原理为采用基因工程重组表达的丙肝病毒特异性抗原（Core、E2、NS3、NS4、NS5)包 被酶联板，辣根过氧化物酶（HRP)标记的鼠抗人IgG(抗r链）单克隆抗体为示踪物，TMB显 色系统，间接ELISA方法检测人血清或血浆中的丙肝病毒IgG抗体。适用于辅助丙型肝炎 和筛查丙型肝炎病毒感染者。具有灵敏度高，特异性强，操作简便，加样变色，反应快速，反 应模式好、重复性好等优点。试剂盒中阳性对照为人HCV阳性血清，材料来源受限，且虽已 进行灭活处理仍有潜在的生物危害风险，需按传染性污染物处理。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于检测丙型肝炎病 毒时作为阳性对照的双功能抗体及其制备方法与应用。解决阳性对照材料的来源受限并避 免使用人血清潜在的风险。
[0008] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于检测丙型肝炎病毒时作为阳性对 照的双功能抗体，所述双功能抗体由鼠抗HCV抗体和抗鼠IgG抗体通过化学修饰的方法制 成。
[0009] 本发明所述双功能抗体可与HCV病毒发生免疫学反应也可与鼠IgG发生免疫学反 应。
[0010] 进一步地，所述鼠抗HCV抗体和抗鼠IgG抗体利用免疫学方法制备。
[0011] 更进一步地，所述双功能抗体的制备方法包括如下步骤：
[0012] (1)制备鼠抗HCV抗体和抗鼠IgG抗体；
[0013] (2)分别制备Fab'：
[0014]利用胃蛋白酶分别消化步骤（1)所得抗体，得到F(ab'）2,再使用2-巯基乙醇将其 还原成Fab'片段，经凝胶过滤纯化；将Ellman试剂（DTNB)与Fab'反应，得到Fab' -疏硝 基苯甲酸（TNB)衍生物，使Fab'受到保护，将巯硝基苯甲酸保护的Fab'经凝胶过滤纯化；
[0015] (3)制备双功能抗体：
[0016] 各取5mg纯Fab'混合于0?lmol/LpH6. 8的磷酸盐缓冲液IOmL中，缓慢加入1% 戊二醛0. 05mL，在室温下放置2小时。在4°C下对0. 05mol/LpH8.OTris缓冲液透析平衡 后50%饱和度的硫酸铵沉淀浓缩，过Superdex-200分子筛凝胶层析柱纯，第一峰即为双功 能抗体。
[0017] 所述鼠抗HCV抗体可为单抗或多抗，在本发明的【具体实施方式】中，优选所述鼠抗 HCV抗体为鼠抗HCV单抗。与多抗相比，批间差小，更有利于质控，制备的试剂盒更稳定。
[0018] 所述抗鼠IgG抗体可为单抗或多抗，在本发明的【具体实施方式】中，优选所述抗鼠 IgG抗体为兔抗鼠IgG多抗。
[0019] 本发明还提供了含有前述双功能抗体的丙型肝炎间接法酶免诊断试剂盒，其中， 所述双功能抗体作为阳性对照。
[0020] 进一步地，所述试剂盒为间接法ELISA诊断试剂盒。
[0021] 进一步地，所述试剂盒还包括：阴性对照、包被板、酶标二抗、样品稀释液、洗液等 常规试剂盒的组成成分。
[0022] 作为优选，试剂盒组成：
【主权项】
1. 一种用于检测丙型肝炎病毒时作为阳性对照的双功能抗体，其特征在于，所述双功 能抗体由鼠抗HCV抗体和抗鼠 IgG抗体通过化学修饰的方法制成。
2. 根据权利要求1所述的双功能抗体，其特征在于，所述鼠抗HCV抗体和抗鼠 IgG抗体 利用免疫学方法制备。
3. 根据权利要求1或2所述的双功能抗体，其特征在于，所述双功能抗体的制备方法包 括如下步骤： (1) 制备鼠抗HCV抗体和抗鼠 IgG抗体； (2) 分别制备Fab' ： 利用胃蛋白酶分别消化步骤（1)所得抗体，得到F(ab'）2,再使用2-巯基乙醇将其还 原成Fab'片段，经凝胶过滤纯化；将Ellman试剂与Fab'反应，得到Fab' -巯硝基苯甲酸 衍生物，使Fab'受到保护，将巯硝基苯甲酸保护的Fab'经凝胶过滤纯化； (3) 制备双功能抗体： 各取5mg纯Fab '混合于0. lmol/L pH6. 8的磷酸盐缓冲液IOmL中，缓慢加入1 %戊二醛 0. 05mL，在室温下放置2小时。在4°C下对0. 05mol/L pH8. OTris缓冲液透析平衡后50%饱 和度的硫酸按沉淀浓缩，过Superdex-200分子筛凝胶层析柱纯，第一峰即为双功能抗体。
4. 根据权利要求3所述的双功能抗体，其特征在于，所述鼠抗HCV抗体为鼠抗HCV单 抗。
5. 根据权利要求3所述的双功能抗体，其特征在于，所述抗鼠 IgG抗体为兔抗鼠 IgG多 抗。
6. 含有权利要求1-5任一项所述双功能抗体的丙型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在 于，所述双功能抗体作为阳性对照。
7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为间接法ELISA诊断试剂 盒。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：阴性对照、包被板、 酶标二抗、样品稀释液和洗液。
9. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照的浓度为0. 05-20mg/mL， 优选为〇. 5mg/mL。
10. 权利要求1-5任一项所述双功能抗体在制备丙型肝炎间接法酶免诊断试剂盒中的 应用。
【专利摘要】本发明涉及酶联免疫试剂盒，具体提供了一种用于检测丙型肝炎病毒时作为阳性对照的双功能抗体，所述双功能抗体由鼠抗HCV抗体和抗鼠IgG抗体通过化学修饰的方法制成。本发明通过利用免疫学方法制备双功能抗体丙型肝炎间接法酶免诊断试剂阳性对照，解决阳性对照材料的来源并避免使用人血清潜在的风险。
【IPC分类】G01N33-576, C07K16-18, G01N33-577
【公开号】CN104558169
【申请号】CN201410775028
【发明人】李银生, 王琳, 程珊, 赵林静, 张付平, 许锦秀, 朱杨阳
【申请人】新乡医学院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月15日