专利名称：鸡马立克氏病毒抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂及其制备方法，特别是涉及一种鸡马立克氏病 毒抗体及其制备方法。
背景技术：
马立克氏病(MD)是由马立克氏疱疹病毒(MDV)导致的免疫抑制性和 致瘤性传染病，它的潜伏期长，隐蔽性强，是鸡的主要传染病之一。由于 该病严重损害鸡免疫系统，除本身可导致累计高达70%以上的致死率外，还 常可导致其它鸡病疫苗的免疫失败或继发感染而造成重大损失。MD疫苗免 疫仅能阻止或减少感染鸡群MD发病，而不能阻断致病性MDV对鸡群的侵入 与传播。因此，MDV感染的诊断与监测不仅是MD防治的重要手段，也是确 证禽用疫苗免疫效果的前提和评价养禽生物安全状况的有效方法。
MDV抗原是MDV在增殖过程中所产生的代谢产物。利用免疫沉淀方法可 从MDV GA株的感染细胞抽提物中鉴定出多达46种病毒特异性多肽，其中， 通过琼扩试验能够鉴定出3个主要MDV抗原，分别命名为A抗原、B抗原和-C抗原，这些病毒性抗原能激发感染免疫鸡体产生相应的抗体。
MDV有三个血清型，从温和型到毒力很强的致瘤株以及它们的致弱株， 均归为血清I型MDV，天然不致瘤的病毒株为血清II型，火鸡疱疹病毒(HVT) 属于血清m型。三个血清型中只有血清I型中的强毒株对鸡是致瘤或致病 性的，且三个血清型的非致瘤毒株都可用作MD的疫苗。其中，MDV血清II 型疫苗所产生的琼扩抗原与MDV A抗原有明显的不同，而HVT疫苗在免疫 鸡体内产生A抗原及其所激发相应的抗体均十分有限，而低敏的经典琼扩 试验难以检出。
目前，制备MDV阳性抗体，大多是从致病性MDV感染鸡、免疫感染后的 免疫幸存鸡或MDV抗原免疫鸡的血清中分离制取，因此，该MDV阳性抗体 制备的方法始终存在着散毒的危险，试验鸡群的饲养、管理等须采取严格 的生物安全控制措施，从而又导致阳性血清的生产成本十分高昂；同时， 在制备的阳性血清中，含有大量的非目的抗体及可能存在的潜在病原，因 而难以被允许进入正规的生产渠道。
目前，国内外从鸡蛋卵黄中提取抗体的方法有多种，其中与本专利申请 相关的有两种。 一种方法包括以下工艺步骤(l)向卵黄液中直接加入大量 氯仿，以抽提其水溶液；(2)采用超滤方法进一步浓縮氯仿抽提的水溶液， 即可得到卵黄中的目的抗体。另一种方法包括以下工艺步骤(1)制备卵黄上清液；(2)采用氯仿对卵黄上清液进行脱脂纯化处理；(3)进行超滤并得到浓縮液，即可得到卵黄中的目的抗体。上述两种提取卵黄抗体的方法均存在以下问题由于先采用氯仿直接对卵黄液或卵黄上清液进行脱脂纯 化处理，再进行超滤，因此，氯仿的消耗多，纯化的工作量大，卵黄抗体 的制备成本高。 发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种鸡马立克氏病毒抗体及其制备 方法，这样，在不影响抗体的特异性和敏感性的基础上，可使抗体的制备 更加安全、简便易行而便于产业化，且制得的抗体产量高、成本低，可用 于免疫监测以及疫病防控。为解决上述技术问题，本发明提供了一种鸡马立克氏病毒抗体，该抗体 通过以下步骤制得(1) 采用马立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株、含有目的抗原的表达 载体、致病性马立克氏病毒及MDV抗原佐剂疫苗中的至少一种，按一定的 接种程序接种鸡，监测接种蛋鸡所产生的目的抗体效价，并在其达到规定 的最低目的抗体效价时，开始收集该接种蛋鸡所产的鸡蛋；(2) 分离出收集的鸡蛋中的卵黄，采用酸水法制备卵黄上清液，对卵 黄上清液进行超滤并得到浓縮液，再采用氯仿对浓縮液进行脱脂纯化处理， 得到目的抗体。本发明应用能够产生或释放出目的马立克氏病毒抗原的生物制剂作为 免疫原，采用一定的程序接种鸡，利用接种蛋鸡作为生物反应器生产特异 性生物活性物质一抗体，该抗体能够通过血液进入鸡蛋中的卵黄，通过对 该抗体的检测并达到规定的效价后，即可收集接种蛋鸡所产鸡蛋，并采取 一定的处理方法提取出卵黄抗体。本发明应用卵黄抗体的生产来替代血清抗体的生产，一个鸡蛋的所获抗 体量可超过常规感染鸡一次放血所得的血清抗体量，大大降低了目的抗体 的生产成本，并最大限度地减少了生产过程中的病原污染。在卵黄抗体的 提取中，对收集的接种蛋鸡的鸡蛋先采用酸水法粗提出卵黄上清液，对卵 黄上清液进行超滤并得到浓縮液，再采用氯仿对浓縮液进行脱脂纯化处理， 得到目的抗体。这样，可显著降低氯仿脱脂纯化处理的工作量，并可节约 氯仿用量50%以上。因此，本发明通过接种蛋鸡所产的鸡蛋来制备目的抗体， 在不影响抗体的特异性和敏感性的基础上，可使抗体的制备更加安全、简 便易行而便于产业化，且制得的抗体产量高、成本低，可用于免疫监测以 及疫病防控。在本发明的制备方法中
所述接种鸡的步骤为健康雏鸡接种马立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗 毒株作为基础免疫，间隔0.5 1.5个月，用含有目的抗原的表达载体、致 病性马立克氏病毒及MDV抗原佐剂疫苗中的一种进行加强免疫，以后，每 隔2 3个月用MDV抗原佐剂疫苗进行强化免疫。
所述接种鸡的步骤为3月龄以上的蛋鸡接种MDV抗原佐剂疫苗或含有 目的抗原的表达载体作为基础免疫，间隔1 1.5个月，用MDV抗原佐剂疫 苗进行加强免疫，以后，每隔2 3个月用MDV抗原佐剂疫苗进行强化免疫。
所述采用酸水法制备卵黄上清液的过程为将卵黄、醋酸钠一醋酸缓冲 液按1: (6 14)的比例混合均匀，纱布过滤以除去卵黄膜，并静置于室温 下6 24h，制得卵黄上清液，所述醋酸钠一醋酸缓冲液的pH值为4. 5 5. 5、 浓度为0. 05 0. 12mol/L。
所述对卵黄上清液进行的超滤采用截留分子量为10 150KD的超滤膜， 操作压差为0. 01 0. 2Mpa，且得到的浓縮液体积为卵黄体积的1/5 1/2。
所述采用氯仿对浓縮液进行脱脂纯化处理的过程为在对卵黄上清液进 行超滤得到的浓縮液内加入终浓度为1 5%的氯仿后，震荡3 5min，在4°C 的温度条件下静置30min 72h，再用8000 10000Xg的离心力离心10 60min，收集上清液，并调节其pH值为6.0 7.4，即得到澄清透明的目的 抗体。
所述马立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株包括血清I型的CVI988株、 血清III型的火鸡疱疹病毒Fc-126株；所述致病性马立克氏病毒为能够有效 分泌马立克氏病毒目的抗原的血清I型MDV温和毒株。
所述MDV抗原佐剂疫苗的制备方法为将提取纯化的MDV抗原按常规方 法配成水相后与油相进行乳化制备与检验，MDV抗原包括MDVA抗原、MDVB 抗原。
收集鸡蛋时，鸡蛋中所达到规定的目的抗体的琼扩效价不低于1: 4， 或者是与所述琼扩效价相当的其它方法所测的效价。
另，所述马立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株不只限于血清I型活疫 苗、血清III型的火鸡疱疹病毒活疫苗，也可以是能够有效分泌马立克氏病 毒目的抗原的其它马立克氏病毒商品疫苗。
在所述MDV抗原佐剂疫苗中，还可加入免疫促进剂，或在向鸡接种MDV
抗原佐剂疫苗的同时，另外使用免疫促进剂。
作为本发明的优选，所述致病性马立克氏病毒为BJ-1株。
具体实施例方式
6实施例一一种鸡马立克氏病毒抗体的制备方法，包括以下步骤(1) 选新生SPF健康雏鸡，接种马立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒 株作为基础免疫，所述的疫苗毒株为血清I型的CVI988株(市售)并按说 明书要求进行免疫；免疫后30天时以MDV抗原佐剂疫苗按0. 5ml/羽剂量皮下注射进行加强 免疫，所述的佐剂疫苗的制备方法为将提取纯化的MDV A抗原按常规方法配成水相后与油相进行乳化制备，要求琼扩效价l: 8以上；加强免疫后第60天时再以该MDV抗原佐剂疫苗按1.0ml/羽剂量肌肉注 射进行强化免疫，以后每隔3个月再用该MDV抗原佐剂疫苗进行一次相同 的强化免疫；自接种蛋鸡产蛋后，开始监测接种蛋鸡所产鸡蛋中的目的抗体效价水 平，当鸡蛋中所达到规定的目的抗体的琼扩效价不低于l: 4时，开始收集 该接种蛋鸡所产的鸡蛋；(2) 分离出收集的鸡蛋中的卵黄，采用酸水法制备卵黄上清液将卵 黄、醋酸钠-醋酸缓冲液按l: 6的比例混合均匀，纱布过滤以除去卵黄膜， 并静置于室温下24h，制得卵黄上清液，所述醋酸钠-醋酸缓冲液的pH值为 5. 5、浓度为0. 12mol/L;对卵黄上清液进行超滤并得到浓縮液超滤来用截留分子量为150KD 的超滤膜，操作压差为0.01Mpa，且得到的浓縮液体积为卵黄体积的1/5;采用氯仿对浓縮液进行脱脂纯化处理在对卵黄上清液进行超滤得到 的浓縮液内加入终浓度为1.5%的氯仿后，震荡5min，在4。C的温度条件下 静置30min，再用10000Xg的离心力离心10min，收集上清液，并调节其 pH值为7.0，即得到澄清透明的目的抗体。实施例二一种鸡马立克氏病毒抗体的制备方法，包括以下步骤 (1)选新生SPF健康雏鸡，接种马立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株 作为基础免疫，所述的疫苗毒株为血清I型的CVI988株(市售)并按说明 书要求进行免疫；免疫后45天时，将致病性马立克氏病毒的BJ-1株复壮后的血毒用MD 疫苗专用稀释液进行100倍稀释后，按0. 2ml/羽剂量皮下注射进行加强免 疫；加强免疫后60天时再以MDV抗原佐剂疫苗按1. 5ml/羽剂量肌肉注射进 行强化免疫，以后每隔2个月用该MDV抗原佐剂疫苗进行一次相同的强化免疫，所述的佐剂疫苗的制备方法为将提取纯化的MDV A抗原按常规方法配成水相后与油相进行乳化制备，要求琼扩效价l: 8以上；自接种蛋鸡产蛋后，开始监测接种蛋鸡所产鸡蛋中的目的抗体效价水平，当鸡蛋中所达到规定的目的抗体的琼扩效价不低于l: 4时，开始收集该接种蛋鸡所产的鸡蛋；(2)分离出收集的鸡蛋中的卵黄，采用酸水法制备卵黄上清液将卵黄、醋酸钠-醋酸缓冲液按i : 12的比例混合均匀，纱布过滤以除去卵黄膜，并静置于室温下12h，制得卵黄上清液，所述醋酸钠-醋酸缓冲液的pH值为 4. 5、浓度为0. 05mol/L;对卵黄上清液进行超滤并得到浓縮液超滤采用截留分子量为10KD的 超滤膜，操作压差为0.2Mpa，且得到的浓缩液体积为卵黄体积的1/2;采用氯仿对浓縮液进行脱脂纯化处理:在对卵黄上清液进行超滤得到的浓縮液内加入终浓度为1.0%的氯仿后，震荡3min，在4。C的温度条件下静 置12h，再用8000Xg的离心力离心10min，收集上清液，并调节其pH值 为6.0，即得到澄清透明的目的抗体。 实施例三一种鸡马立克氏病毒抗体的制备方法，包括以下步骤(1) 以马立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株的血清III型的火鸡疱疹病 毒Fc-126株(市售)按说明书要求免疫新生SPF健康雏鸡，免疫后15天 时再以马立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株的血清I型的CVI988株(市售)按说明书要求进行二次免疫作为基础免疫；基础免疫后15天时，以MDV抗原佐剂疫苗按0. 5ml/羽剂量肌肉注射进 行加强免疫，所述的佐剂疫苗的制备方法为将提取纯化的MDV A抗原按 常规方法配成水相后与油相进行乳化制备，要求琼扩效价l: 16以上；加强免疫后60天时再以该MDV抗原佐剂疫苗按1.0ml/羽剂量肌肉注射 进行强化免疫，此后每隔2个月用MDV抗原佐剂疫苗进行一次相同的强化 免疫；当该接种鸡所产鸡蛋中目的抗体的琼扩效价达1 : 4以上时收集该接种 蛋鸡所产的鸡蛋；(2) 分离出收集的鸡蛋中的卵黄，采用酸水法制备卵黄上清液将卵 黄、醋酸钠-醋酸缓冲液按1 : 14的比例混合均匀，纱布过滤以除去卵黄膜， 并静置于室温下6h，制得卵黄上清液，所述醋酸钠-醋酸缓冲液的PH值为 5.0、浓度为0. 10mol/L;对卵黄上清液进行超滤并得到浓縮液超滤采用截留分子量为100KD的超滤膜，操作压差为O. 1Mpa，且得到的浓縮液体积为卵黄体积的3/10;采用氯仿对浓縮液进行脱脂纯化:在对卵黄上清液进行超滤得到的浓縮 液内加入终浓度为5%的氯仿后，震荡5min，在4°C的温度条件下静置72h， 再用9000Xg的离心力离心60min，收集上清液，并调节其pH值为7.4， 即得到澄清透明的目的抗体。实施例四一种鸡马立克氏病毒抗体的制备方法，包括以下步骤(1) 选新生SPF健康雏鸡，接种马立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株 作为基础免疫，所述的疫苗毒株为血清III型的火鸡疱疹病毒Fc-126株(市 售)并按说明书要求进行免疫；基础免疫后40天时，将致病性马立克氏病毒的BJ-1株复壮后的血毒用 MD疫苗专用稀释液进行100倍稀释后，按0. 2ml/羽剂量皮下注射进行加强 免疫；加强免疫后60天时以MDV抗原佐剂疫苗按1. Oml/羽剂量肌肉注射进行 强化免疫，此后每隔3个月用该MDV抗原佐剂疫苗进行一次相同的强化免 疫，所述MDV抗原佐剂疫苗的制备同实施例三；自接种蛋鸡产蛋后，开始监测接种蛋鸡所产鸡蛋中的目的抗体效价水 平，当鸡蛋中所达到规定的目的抗体的琼扩效价不低于1: 4时，开始收集 该接种蛋鸡所产的鸡蛋；(2) 其后的鸡马立克氏病毒抗体的制备同实施例一。 实施例五一种鸡马立克氏病毒抗体的制备方法，包括以下步骤(1) 选3月龄的SPF蛋鸡，以MDV抗原佐剂疫苗作为免疫原，按0. 5ml/ 羽剂量肌肉注射作为基础免疫，所述MDV抗原佐剂疫苗的制备方法为将 提取纯化的MDV A抗原按常规方法配成水相后与油相进行乳化制备，要求琼扩效价l: 16以上；在基础免疫后30天时用该MDV抗原佐剂疫苗按1. Oml/羽剂量肌肉注射 进行加强免疫；加强免疫后70天时再以该MDV抗原佐剂疫苗按1. 5ml/羽剂量肌肉注射 进行强化免疫，此后，每隔2个月用该MDV抗原佐剂疫苗进行一次相同的 强化免疫；监测接种蛋鸡所产鸡蛋中的目的抗体效价水平，当鸡蛋中所达到规定的 目的抗体的琼扩效价不低于l: 4时，开始收集该接种蛋鸡所产的鸡蛋。(2) 其后的鸡马立克氏病毒抗体的制备同实施例二。9实施例六一种鸡马立克氏病毒抗体的制备方法，包括以下步骤-(1) 选新生SPF健康雏鸡，接种马立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株 作为基础免疫，所述的疫苗毒株为血清I型的CVI988株(市售)并按说明 书要求进行免疫；免疫后30天时，用含有目的抗原的表达载体按150ug/羽剂量肌肉注 射进行加强免疫；加强免疫后2个月时再以MDV抗原佐剂疫苗按1. Oml/羽剂量肌肉注射 进行强化免疫，所述MDV抗原佐剂疫苗的制备方法同实施例一，以后每隔 2. 5个月用同样的MDV抗原佐剂疫苗进行一次相同的强化免疫；自接种蛋鸡产蛋后，开始监测接种蛋鸡所产鸡蛋中的目的抗体效价水 平，当鸡蛋中所达到规定的目的抗体的琼扩效价不低于l: 4时，开始收集 该接种蛋鸡所产的鸡蛋；(2) 其后的鸡马立克氏病毒抗体的制备同实施例一。 实施例七一种鸡马立克氏病毒抗体的制备方法，包括以下步骤(1) 选3月龄的SPF蛋鸡，用含有目的抗原的表达载体按200ug/羽 剂量肌肉注射作为基础免疫；在基础免疫后45天，以MDV抗原佐剂疫苗按1. Oml/羽剂量进行皮下注 射作为加强免疫，所述MDV抗原佐剂疫苗的制备方法同实施例三；在加强免疫后60天再以该MDV抗原佐剂疫苗按1.5ml/羽剂量肌肉注射 进行强化免疫，此后，每隔3个月用该MDV抗原佐剂疫苗进行一次相同的 强化免疫；监测接种蛋鸡所产鸡蛋中的目的抗体效价水平，当鸡蛋中所达到规定的 目的抗体的琼扩效价不低于l: 4时，开始收集该接种蛋鸡所产的鸡蛋。(2) 其后的鸡马立克氏病毒抗体的制备同实施例三。 以上所述的仅是本发明的七种实施方式。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干变型和改 进，这些均应视为属于本发明的保护范围。比如MDV抗原还可为MDVB抗 原；用制得的液相的目的抗体制成冻干抗体以利于保存和应用；当抗体效 价保持较高水平或下降至较低水平时，可延期或提前实施强化免疫；因生 产厂家的不同，所选择的超滤膜应以有效截留住抗体为准，而不能仅依据 所标注的截留分子量为准。
权利要求
1、一种鸡马立克氏病毒抗体的制备方法，包括以下步骤(1)采用马立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株、含有目的抗原的表达载体、致病性马立克氏病毒及MDV抗原佐剂疫苗中的至少一种，按一定的接种程序接种鸡，监测接种蛋鸡所产生的目的抗体效价，并在其达到规定的最低目的抗体效价时，开始收集该接种蛋鸡所产的鸡蛋；(2)分离出收集的鸡蛋中的卵黄，采用酸水法制备卵黄上清液，对卵黄上清液进行超滤并得到浓缩液，再采用氯仿对浓缩液进行脱脂纯化处理，得到目的抗体。
2、 根据权利要求l所述的鸡马立克氏病毒抗体的制备方法，其特征在 于所述接种鸡的步骤为健康雏鸡接种马立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗 毒株作为基础免疫，间隔0.5 1.5个月，用含有目的抗原的表达载体、致 病性马立克氏病毒及MDV抗原佐剂疫苗中的一种进行加强免疫，以后，每 隔2 3个月用MDV抗原佐剂疫苗进行强化免疫。
3、 根据权利要求l所述的鸡马立克氏病毒抗体的制备方法，其特征在 于所述接种鸡的步骤为3月龄以上的蛋鸡接种MDV抗原佐剂疫苗或含有 目的抗原的表达载体作为基础免疫，间隔1 1.5个月，用MDV抗原佐剂疫 苗进行加强免疫，以后，每隔2 3个月用MDV抗原佐剂疫苗进行强化免疫。
4、 根据权利要求l所述的鸡马立克氏病毒抗体的制备方法，其特征在 于所述采用酸水法制备卵黄上清液的过程为将卵黄、醋酸钠一醋酸缓 冲液按1: (6 14)的比例混合均匀，纱布过滤以除去卵黄膜，并静置于室温下6 24h，制得卵黄上清液，所述醋酸钠一醋酸缓冲液的pH值为4. 5 5.5、浓度为0. 05 0. 12mol/L。
5、 根据权利要求l所述的鸡马立克氏病毒抗体的制备方法，其特征在 于所述对卵黄上清液进行的超滤采用截留分子量为10 150KD的超滤膜， 操作压差为0. 01 0. 2Mpa，且得到的浓缩液体积为卵黄体积的1/5 1/2。
6、 根据权利要求l所述的鸡马立克氏病毒抗体的制备方法，其特征在 于所述采用氯仿对浓縮液进行脱脂纯化处理的过程为在对卵黄上清液 进行超滤得到的浓縮液内加入终浓度为1 5%的氯仿后，震荡3 5min，在 4'C的温度条件下静置30min 72h，再用8000 10000Xg的离心力离心 10 60min，收集上清液，并调节其pH值为6. 0 7. 4，即得到澄清透明的 目的抗体。
7、 根据权利要求l、 2、 4、 5、 6中任何一项所述的鸡马立克氏病毒抗 体的制备方法，其特征在于所述马立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株包 括血清I型的CVI988株、血清III型的火鸡疱疹病毒Fc-126株；所述致病性马立克氏病毒为能够有效分泌马立克氏病毒目的抗原的血清I型MDV温和 毒株。
8、 根据权利要求1至6中任何一项所述的鸡马立克氏病毒抗体的制备 方法，其特征在于所述MDV抗原佐剂疫苗的制备方法为将提取纯化的 MDV抗原按常规方法配成水相后与油相进行乳化制备与检验，MDV抗原包括 MDV A抗原、MDV B抗原。
9、 根据权利要求1至6中任何一项所述的鸡马立克氏病毒抗体的制备 方法，其特征在于收集鸡蛋时，鸡蛋中所达到规定的目的抗体的琼扩效 价不低于l: 4，或者是与所述琼扩效价相当的其它方法所测的效价。
10、 根据权利要求1所述的鸡马立克氏病毒抗体的制备方法制备的鸡马 立克氏病毒抗体。
全文摘要
本发明为一种鸡马立克氏病毒抗体及其制备方法。制备方法为采用马立克氏病(MD)病毒(MDV)疫苗毒株、含有目的抗原的表达载体、致病性马立克氏病毒及MDV抗原佐剂疫苗中的至少一种，按一定的接种程序接种鸡，监测接种蛋鸡所产生的目的抗体效价，并在其达到规定的最低目的抗体效价时，开始收集该接种蛋鸡所产的鸡蛋；分离出收集的鸡蛋中的卵黄，采用酸水法制备卵黄上清液，对卵黄上清液进行超滤并得到浓缩液，再采用氯仿对浓缩液进行脱脂纯化处理，得到目的抗体。这样，在不影响抗体的特异性和敏感性的基础上，可使抗体的制备更加安全、简便易行而便于产业化，且制得的抗体产量高、成本低，可用于免疫监测以及疫病防控。
文档编号C07K16/08GK101575374SQ20091002785
公开日2009年11月11日 申请日期2009年5月18日 优先权日2009年5月18日
发明者丁维民, 孙格格, 翠 张, 张训海, 旋 王, 磊 赵, 争 龚 申请人:张训海