专利名称：抗SARS病毒人源性抗体lgG Fab片段的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程领域，具体涉及抗SARS病毒人源性抗体IgGFab片段。
背景技术：
2003年非典型性肺炎即严重呼吸道综合症(Severe AcuteRespiratory Syndrome，SARS)在世界范围内爆发流行。该疾病主要通过飞沫传播，具有潜伏期长、传染性高、传播快、症状重、死亡率高、无特效药物、无疫苗预防等特点。据报道，该病由新种的冠状病毒——SARS病毒所引起，已证实人冠状病毒基因编码的糖蛋白之一E2亦称S蛋白(spike protein)，可与上皮细胞表面受体相互作用，是介导病毒吸附与细胞膜融合的关键。在对人冠状病毒E229毒株的研究中证明，抗S蛋白417至547位氨基酸部位的抗体可以阻断该毒株与靶细胞的结合，豚鼠抗该毒株的抗血清可以中和该病毒的传染性。国内亦有感染SARS病毒的医务人员应用SARS恢复期病人的血清成功控制自身病情的报道。鉴于冠状病毒毒株存在的变异，防患于未然，寻找有效的药物或疫苗仍然是本领域研究的重点。
发明内容
本发明的目的是构建人免疫球蛋白G基因文库，重组表达冠状病毒S蛋白，制备抗SARS病毒人源性基因工程抗体，用于SARS的诊断和治疗。
本发明的目的通过下述方法和步骤实现，1.构建抗体库取恢复期病人外周血，分离淋巴细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA，扩增得到人免疫球蛋白G重轻链可变区基因，构建人免疫球蛋白G Fab抗体库。
2.重组表达S蛋白构建表达质粒，IPTG诱导表达，提纯，复性。酶联免疫吸附实验检测重组S蛋白特异性和敏感性。
3.筛选抗冠状病毒人免疫球蛋白G人免疫球蛋白G Fab抗体库DNA转化大肠杆菌，IPTG诱导表达，以重组S蛋白作为抗原，通过克隆印迹法、ELISA方法及间接免疫荧光反应筛选得到阳性克隆AS3-3。
4.抗冠状病毒Fab抗体片段AS3-3的特性分析对所得阳性克隆AS3-3进行测序，推定氨基酸序列，并进行同源性分析。对所得抗体片段进行纯化，以试剂盒测定蛋白含量，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其纯度，同时以Western blot检测该Fab抗体与重组抗原S蛋白的反应性，并进行亲和力检测。
实验证实，应用重组蛋白技术及抗体库技术获得的抗冠状病毒人源性基因工程抗体Fab片段AS3-3，与重组冠状病毒S蛋白具有较高的亲和力，并可特异性识别冠状病毒感染的EU 14细胞。可通过进一步实验证实该Fab片段与冠状病毒S蛋白的高度亲和可发挥抑制冠状病毒对宿主细胞的吸附与穿入，从而中和冠状病毒传染性的作用，对SARS的治疗和预防工作具有重要的应用价值。
动物源性单克隆抗体制备技术虽已普及，但应用于人体时可引起人抗异源性抗体发应，虽可通过抗体人源化技术得以改进，但过程繁杂，耗时耗力，短期难以取得成效。本发明克服了已有技术的缺陷，获得的人源性抗冠状病毒因工程抗体Fab片段，由于无Fc段，在发挥中和病毒与宿主细胞作用的同时，不会激活补体和引起人体免疫反应等病理损害，应用于人体安全可靠。
图1.人免疫球蛋白Fab表达载体pFab-His2图2.阳性克隆AS3-3的间接免疫荧光检测其中，A-阳性克隆AS3-3与SARS冠状病毒感染细胞(species EU 14)的间接免疫荧光反应，B-阳性克隆AS3-3与无SARS冠状病毒感染细胞(species EU14)的间接免疫荧光反应。
图3.SDS-PAGE检测Fab抗体纯度其中，A-考马斯亮兰染色FabB-辣根过氧化酶标记的山羊抗人κ链抗体C-辣根过氧化酶标记的氨基三乙酸(Qiagen)1-大肠杆菌JM 109表达的Fab片段
2-纯化的重组Fab片段图4.Western blot检测Fab抗体与重组抗原S蛋白的反应性其中，1-考马斯亮兰染色。
2-重组人抗SARS冠状病毒Fab3-人Fab4～7 SARS患者恢复期血清8-正常人血清9-抗SARS病毒S蛋白多克隆抗体(IMG-542)10-正常兔IgG。
具体实施例方式
实施例11.构建抗体库取2名SARS恢复期病人外周抗凝血(每人5ml)(上海市疾病控制中心)，以Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，Sweden)分离淋巴细胞，用试剂盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)提取总RNA。将总RNA用Gene-Amp RNA PCR试剂盒(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，Conn)以Oligo(dT)16逆转录成cDNA，并以人IgG轻重链可变区保守序列的上、下游引物(Invitrogen)(κ链5′端引物-序列3、序列4、序列5、序列6；κ链3′端引物-序列7；λ链5′端引物-序列8、序列9、序列10、序列11、序列12、序列13；λ链3′端引物-序列14；γ链5′端引物-序列15、序列16、序列17、序列18、序列19、序列20；γ链3′端引物-序列21；序列22、序列23、序列24)进行免疫球蛋白γ、κ、λ链基因的PCR扩增。PCR产物经试剂盒(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)提纯后，分别以AscI和NheI(NEW ENGLAND BioLabs)双酶切κ链和λ链产物。酶切后的κ链和λ链产物与人免疫球蛋白Fab表达载体pFab-His2(图2)(Am.J.Trop.Med.Hyg.6035-40.1999)连接，随后电转入大肠杆菌JM109(Takara)中，构成轻链库。分别以SfiI和NotI(NEW ENGLAND BioLabs)对轻链库及γ链PCR产物进行酶切修饰，连接反应后，电转导入大肠杆菌JM109中，构成9.8×106的非依赖性克隆滴度的抗体库。
2.重组表达S蛋白棘突蛋白(S蛋白)是冠状病毒的外部糖蛋白，具有多种功能，与病毒的致病性及组织亲嗜性密切相关。全长S蛋白过大，可能会影响与抗体的结合，本发明首先合成编码S蛋白(21477～25244)所需的DNA片段，而后以PCR扩增772～1719位碱基(Invitrogen合成)，得到S蛋白部分基因片段(氨基酸位点257～573)。该基因片段经过BamHI和EcoRI酶切后，与表达载体pET21b(Novagen)连接，转化入大肠杆菌JM109中，将获得的阳性克隆进行序列分析，将含有正确序列的质粒转入表达菌BL21(DE3)(Novagen)，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(上海生工)诱导表达，提取包涵体蛋白，并进行蛋白复性(根据Novagen的包涵体蛋白提纯方法)，其分子量为30kDa。以提纯的重组蛋白0.1μg/100μl包被酶标板，检测重组蛋白的特异性和敏感性。当稀释度为1∶400时，病人血清反应的OD490值为1.744～1.945，而正常对照为0.424～0.492。当稀释度为1∶800时，患者血清读数为1.067～1.381，正常对照为0.132～0.147。提示该重组抗原可以作为SARS病毒棘突蛋白的部分片段，用于抗SARS免疫球蛋白抗体库的筛选。
3.筛选抗冠状病毒人免疫球蛋白G取9.8×106的非依赖性克隆滴度的抗体库DNA 10ng，转化100μlJM109大肠杆菌，将菌液涂布在Luria broth(10g sodii chloridum，10gtryptone，5g yeast extract/L，PH7)平板(含氨苄青霉素50μg/ml)上，37℃培养7小时，待克隆(约5×103个克隆/90mm直径平板)直径为0.1～0.2mm时，以直径为82mm硝酸纤维素膜(Armacia/Pharmacia)覆于平板上，待克隆完全转移至膜上，将膜置于含1.0mM IPTG的LB平板上，30℃诱导表达6小时，而后用溶菌酶、DNA酶和牛血清白蛋白(100mMTris-HCl[pH7]，150mM NaCl，5mM MgCl2，1.5％ BSA，1mg of DNase，40mglysozyme/ml)对膜进行溶菌。经洗涤除去膜上残留的细菌碎片等，以牛血清白蛋白(BSA)封闭，与125μg纯化的重组蛋白反应，随后分别与阳性血清、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG Fc抗体(ICNPharmaceuticals，Aurora，Ohio)反应，显色(HRP-1000，Konica Co，Tokyo，Japan)。每次以4～8张膜进行筛选，在膜上发现深染的克隆都作为阳性克隆，此为克隆印迹法。
或从抗体库中取10ng DNA，转化100μlJM109大肠杆菌，挑取转化所得的每个单个克隆至2ml含氨苄青霉素的super broth培养基(30gtryptone，20g yeast extract，10g 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid[MOPS]/L，pH7)中，待OD600为0.6～0.8时加入IPTG，使其最终浓度为0.1mM，30℃诱导表达10～12小时，14000rpm 2分钟离心收集细菌，细菌沉淀中加入100μl含1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)的PBS，悬浮细菌，4℃进行超声粉碎，而后14000rpm离心10分钟，取上清液，加入包被有0.1μg重组S蛋白/孔的酶标板上，进行酶联免疫反应，以HRP标记的抗人IgGFab(ICN Pharmaceuticals，Aurora，Ohio)为二抗，以邻苯二胺(o-phenylene-diamin，OPD)显色。每块酶标板上均加入阳性血清为阳性对照，OD490读数高于一定数值即为阳性。
将克隆印迹法或ELISA筛选所得的阳性克隆挑入25ml含氨苄青霉素的的SB培养液中，37℃培养至OD600为0.6～0.8时，加入IPTG，使其最终浓度为0.1mM，30℃诱导表达10～12小时，14000rpm 2分钟离心收集细菌，细菌沉淀中加入500μl含1mM PMSF的PBS，悬浮细菌，4℃进行超声粉碎，而后14000rpm离心10分钟，取上清液，加入每孔包被有0.1μg重组蛋白或其他无关蛋白如BSA、重组溶组织内阿米巴150kDa表面蛋白等的酶标板上，进行酶联免疫反应，以HRP标记的抗人IgG Fab为二抗，显色。当重组S蛋白与其他无关蛋白的OD490读数有显著性差别时，即将该克隆的细菌混悬液与SARS冠状病毒感染的细胞(species EU 14)(EUROIMMUNU LLC购入)进行间接免疫荧光反应，当细胞出现特异性荧光反应，即为阳性克隆。
累计筛选约4.8×104个克隆，其中阳性克隆AS3-3与冠状病毒感染细胞呈明显的特异性结合反应。
4.抗冠状病毒Fab抗体片段AS3-3的特性分析取阳性克隆AS3-3的质粒，分别以AscI-NdeI和SfiI-NotI限制性内切酶酶切，获得轻链和重链基因，再与经酶切修饰的测序载体CV-2和CV-1连接，转化大肠杆菌JM109，分别提取含轻链或重链基因的质粒DNA，以M13Reverse引物(5′-GGATAACAATTTCACACAGG-3′)，及BigDyeFerminatorV3.1 cycle测序试剂盒(Applied Biosystems，Foster City Calif)进行测序，测序反应在ABIPrism3100 geneticAnalyzer(Applied Biosystems)上进行。并以GENETYX-MAC Verll进行氨基酸序列推定(序列1、序列2)，以IgBlast进行同源性分析。
表1是阳性克隆AS3-3基因序列的同源性比较结果。
表1.
由于Fab抗体含有6个His-Tag，且重链与His相连，故选用His结合树脂(Novagen，Madison，Wis.)进行提纯。阳性克隆AS3-3进行大量培养和诱导表达后，收集细菌，进行溶菌和超声粉碎，离心取上清液进行纯化。以1M咪唑溶出纯化的Fab片段，以DC Protein Assay(BioRad)测定蛋白含量，并通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测其纯度(图3)。同时以Western blot检测Fab抗体与重组抗原S蛋白的反应性(图4)。纯化的抗体以Biocore3000(Biocore AB，Uppsala Sweden)检测其亲和力，以纯化的重组抗原S蛋白包被后，分别以浓度为2.5μg/ml，1.25μg/ml，0.625μg/ml，0.3125μg/ml的Fab抗体片段与其进行反应，以BIAevalution3.1软件求出结合率(KA)和解离率(KD)分别为5.05×107(1/M)和1.98×10-8(M)结果提示该Fab抗体与重组冠状病毒S蛋白具有较高的亲和力。
表2是抗重组冠状病毒S蛋白Fab抗体结合率(KA)和解离率(KD)。
表2
SEQUENCE LISTING<110>复旦大学<120>抗SARS病毒人源性抗体IgG Fab片段<130>抗SARS病毒20050622<160>24<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>121<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Phe Ser Thr Tyr20 25 30Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Arg Ile Ser His Asp Gly Ser Gln Thr His Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Gln Gly Arg Phe Gly Val Ser Arg Asp Asn Ser Asn Tyr Thr Ala Tyr65 70 75 80Val Gln Leu Asn Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Ala Tyr Ser Ser Thr Pro Asp Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly
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<212>DNA<213>Homo sapiens<400>3ccgctagcgm catycagwtg acccagtctc c 31<210>4<211>31<212>DNA<213>Homo sapiens<400>4ccgctagcga trttgtgatg acycagwctc c 31<210>5<211>31<212>DNA<213>Homo sapiens<400>5ccgctagcga aattgtgwtg acgcagtctc c 31<210>6<211>31<212>DNA<213>Homo sapiens<400>6ccgctagcga catcgwghtg acccagtctc c 31<210>7<211>34<212>DNA<213>Homo sapiens<400>7ttggcgcgcc acactctccc ctgttgaagc tctt34<210>8
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<210>23<211>34<212>DNA<213>Homo sapiens<400>23ccgcggccgc tgtgtgagtt gtgtcaccaa gtgg34<210>24<211>34<212>DNA<213>Homo sapiens<400>24ccgcggccgc tgggggacca tatttggact caac3权利要求
1.抗SARS病毒人源性抗体IgG Fab片段，其特征是具有序列1，序列2的氨基酸序列。
2.按权利要求1所述的抗SARS病毒人源性抗体IgG Fab片段，其特征是所述的抗体片段的蛋白质包括重链和轻链，其中重链部分由121个氨基酸组成，含有三个互补决定区CDR1，CDR2，CDR3，和四个骨架区FR1，FR2，FR3，FR4；其中轻链部分由110个氨基酸组成，含有三个互补决定区CDR1，CDR2，CDR3和四个骨架区FR1，FR2，FR3，FR4。
3.按权利要求2所述的抗SARS病毒人源性抗体IgG Fab片段，其中重链部分的FR1含有30个氨基酸，CDR1含有5个氨基酸，FR2含有14个氨基酸，CDR2含有17个氨基酸，FR3含有32个氨基酸，CDR3含有12个氨基酸，FR4含有11个氨基酸；轻链部分的FR1含有22个氨基酸，CDR1含有16个氨基酸，FR2含有15个氨基酸，CDR2含有7个氨基酸，FR3含有30个氨基酸，CDR3含有9个氨基酸，FR4含有11个氨基酸。
4.权利要求1所述的抗SARS病毒人源性抗体IgG Fab片段在制备检测冠状病毒感染的制剂中的用途。
5.权利要求1所述的抗SARS病毒人源性抗体IgG Fab片段在制备治疗冠状病毒感染的药物中的用途。
全文摘要
本发明属基因工程领域，具体涉及抗SARS病毒人源性抗体。本发明应用重组蛋白技术及抗体库技术获得的抗冠状病毒人源性基因工程抗体Fab片段AS3－3，实验证实与重组冠状病毒S蛋白具有较高的亲和力，并可特异性识别冠状病毒感染的EU 14细胞，可用于SARS的诊断和治疗。本发明的抗体片段在发挥中和病毒与宿主细胞作用的同时，不会激活补体和引起人体免疫反应等病理损害，应用于人体安全可靠。对SARS的治疗和预防工作具有重要的应用价值。
文档编号G01N33/563GK1903878SQ20051002815
公开日2007年1月31日 申请日期2005年7月26日 优先权日2005年7月26日
发明者刘金也, 胡庚熙, 杨小丽, 程训佳 申请人:复旦大学