一种区别鸭肝炎病毒1型和新血清型的pcr-rflp引物及方法
【技术领域】
[0001]本发明属于兽医传染病快速诊断技术领域，具体涉及一种区别鸭肝炎病毒I型和新血清型的PCR-RFLP引物及其方法。
【背景技术】
[0002]鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus，DHV)是由鸭肝炎病毒引起的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害3周龄内雏鸭，以肝炎为典型特征。该病发病急、病程短、发病率和死亡率高，严重威胁养鸭业健康发展[杨维星，施少华，陈红梅，等.3株鸭肝炎病毒I型全基因序列分析[J].中国农学通报，2010，26 (14):8-12.]。
[0003]1999年中国农业大学苏敬良等从发病的北京鸭和樱桃谷鸭中分离到2株与鸭肝炎病毒I型无血清学相关性的鸭肝炎病毒新血清型(Duck hepatitis virus newserotype, DHV-N)。本研究室施少华等以苏敬良等惠赠的鸭肝炎病毒新血清型DHV-N G株进行了基因组序列测定，发现鸭肝炎病毒新血清型G株和鸭肝炎病毒I型的5’UTR和3’UTR相比，发生了较大的插入与缺失现象，并明确鸭肝炎病毒I型和新血清型存在较大差异[施少华，程龙飞，傅光华，等.鸭肝炎病毒新血清型基因组序列分析[J].微生物学报，2009，49
[3]:309-315.]ο
[0004]目前，关于鸭肝炎病毒I型和新血清型病原学检测的PCR方法和荧光定量方法均有相关报道。但相关方法均需要分别针对鸭肝炎病毒I型和新血清型设计特异性引物，建立双重PCR检测，但双重PCR条件优化较为繁琐。本发明提供的方法仅需一组引物(比分别设计特异性引物检测时少I组引物)结合酶切位点差异进行RFLP分析，无虚复杂繁琐的条件优化过程，本发明在鸭肝炎病毒I型和新血清型病原学检测上快捷准确，可填补国内外相关领域研究空白。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种区别鸭肝炎病毒I型和新血清型的PCR-RFLP引物及方法。该引物能有效区分鸭肝炎病毒I型和新血清型感染(或共感染)，为水禽养殖业健康养殖提供技术保证。
[0006]本发明根据鸭肝炎病毒I型和新血清型基因组中序列特征，设计一组引物能同时对鸭肝炎病毒I型和新血清型进行RT-PCR产阳性扩增，根据鸭肝炎病毒新血清型扩增RT-PCR产物中有特异性的Xho I酶切位点，而鸭肝炎病毒I型扩增RT-PCR产物中没有Xho I酶切位点(见图1)，来对建立一种对鸭肝炎病毒I型和新血清型进行快速检测的PCR-RFLP 方法。
[0007]从图1可以看出，鸭肝炎病毒I型在此处均为CAAGAG，鸭肝炎病毒新血清型均为CTCGAG，刚好为的Xho I酶识别酶切位点。
[0008]本发明采用以下技术方案: 一种区别鸭肝炎病毒I型和新血清型的PCR-RFLP方法，包括以下步骤:
(O提取鸭肝炎病毒I型和新血清型核酸RNA ;
(2)用引物Pl和P2同时对鸭肝炎病毒I型和新血清型进行RT-PCR扩增，得到相应的目的基因片段；
(3)取PCR产物经XhoI酶切后进行RFLP分析。
[0009]其中，PCR引物需满足如下要求:
(1)该PCR产物需选择鸭肝炎病毒I型和新血清型编码区基因中的保守区域进行设计，以便能一个RT-PCR反应能对鸭肝炎病毒I型和新血清型核酸RNA均能进行RT-PCR扩增，并获得相同大小的目的基因片段；
(2)该PCR产物需选择鸭肝炎病毒I型和新血清型编码区基因中的保守区域进行设计时必须跨过鸭肝炎病毒新血清型基因中的Xho I酶切位点，以便对PCR产物能够进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析。
[0010]根据以上要求，所述的步骤(2)的扩增引物Pl和P2的序列为:
上游引物 Pl:5’ - CAATTGAGGACATGGCTAAGAAA-3’，
下游引物 P2:5’ - TCAGAGASCCRTCRAAWCCAGAAA -3’。
[0011]其中，所述的步骤(2) PCR扩增产物经大小为555bp。
[0012]其中S=C/G，W= A/T，R=A/G。
[0013]其中，所述的步骤(3)PCR产物经Xho I酶切后进行RFLP分析:在所扩增的目的片段中仅鸭肝炎病毒新血清型可被Xho I酶切后经常规琼脂糖凝胶电泳检测片段为2段，大小分别为349bp和206bp，而鸭肝炎病毒I型的目的片段中不含被Xho I酶切位点，RT-PCR产物被Xho I酶切后经常规琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变，仍然是555bp。
[0014]所述的引物Pl和P2在检测鸭肝炎病毒I型和新血清型试剂盒中的应用。
[0015]本发明的有益效果:本发明所采用引物，特异性强，灵敏度高；鉴定方法简单，快捷和准确率较高。使用本引物对对本临床送检20份疑似鸭肝炎病毒I型和新血清型感染病料，提取核酸后进行RT-PCR扩增，后进行Xho I酶切检测，其中肝炎病毒I型感染6株、鸭肝炎病毒新血清型感染5株，该20份样品没有检测到共感染。同时对本研究分离鉴定的鸭肝炎病毒I型(3株，GenBank登录号JX390982-390984)和新血清型(I株GenBank登录号EU755009)进行验证，仅鸭肝炎病毒新血清型能够被酶切成2段，而鸭肝炎病毒I型片段大小不变。
【附图说明】
[0016]图1鸭肝炎病毒I型和新血清型基因比对。
[0017]图2为鸭肝炎病毒I型和新血清型进行快速检测的PCR-RFLP方法的电泳图。M为DL 2 000 DNA Marker, I为鸭肝炎病毒I型RT-PCR产物，2为鸭肝炎病毒新血清型RT-PCR产物，3为经Xho I酶切鸭肝炎病毒I型RT-PCR产物，4为经Xho I酶切鸭肝炎病毒新血清型RT-PCR产物，5为阴性对照。
【具体实施方式】
[0018]下面实施例对本发明做进一步的描述。
[0019]实施例1
1、毒株:
鸭肝炎病毒I型和新血清型均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。
[0020]2、引物设计与合成
根据鸭肝炎病毒I型和新血清型基因特征设计引物Pl和P2，其中引物Pl和P2 序列为:上游引物 Pl:5’ - CAATTGAGGACATGGCTAAGAAA-3，，下游引物 P2:5’ -TCAGAGASCCRTCRAAWCCAGAAA _3，。
[0021]3、RT-PCR 扩增
以常规方法提取鸭肝炎病毒I型和新血清型核酸RNA。用所设计的特异性引物Pl和P2进行RT-PCR扩增，扩增片段大小均约555 bp。RT-PCR扩增(以宝生物工程(大连)有限公司 PrimeScript ? One Step RT-PCR Kit Ver.2 (Dye Plus)为例)体系为 50 μ L，其中PrimeScript I Step Enzyme Mix 2yL、2Xl Step Buffer (Dye Plus) 25 μ L、上下游引物(20 μ M/mL)各I μ L、RNA模板2 μ L，补充灭菌去离子水至终体积50 μ L0反应条件为50°C反转录 30 min，94°C预变性 2min，随后进行 94°C 40s,53°C 30s,72°C 35s，进行 35 个循环后，72°C延伸7min。
[0022]4、RFLP 分析
RT-PCR反应结束后，将鸭肝炎病毒I型和新血清型RT-PCR产物进行Xho I酶切。酶切体系为 30 μ L，其中 1X QuickCut Buffer 3 μ L，RT-PCR 产物 15 μ L，QuickCut ?Xho I酶I yL、补充灭菌去离子水至终体积30yL。混匀后，经37°C水浴8 min，加入3 μ LlO X Loading Buffer终止，进行常规琼脂糖凝胶电泳分析，对检测样品进行分析鸭肝炎病毒I型和新血清型感染类型。
[0023]5、临床应用
使用本方法对本临床送检20份疑似鸭肝炎病毒I型和新血清型感染病料，提取核酸后进行RT-PCR扩增，后进行Xho I酶切检测，其中肝炎病毒I型感染6株、鸭肝炎病毒新血清型感染5株，该20份样品没有检测到共感染。同时对本研究分离鉴定的鸭肝炎病毒I型(3株，GenBank登录号JX390982-390984)和新血清型(I株GenBank登录号EU755009)进行验证，仅鸭肝炎病毒新血清型能够被酶切成2段，而鸭肝炎病毒I型片段大小不变。根据建立的PCR- RFLP方法，可在3小时内对确定感染的水鸭肝炎病毒I型和新血清型感染类型进行准备判断。
[0024]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一种区别鸭肝炎病毒I型和新血清型的PCR-RFLP引物，其特征在于:所述引物序列为上游引物引物Pl:5’ - CAATTGAGGACATGGCTAAGAAA-3’，下游引物P2:5’ -TCAGAGASCCRTCRAAWCCAGAAA _3，。2.利用权利要求1所述引物区别鸭肝炎病毒I型和新血清型的PCR-RFLP方法，其特征在于:包括以下步骤: (O从检测样品中提取病毒的核酸； (2)用上游引物引物Pl:5’ - CAATTGAGGACATGGCTAAGAAA-3’，下游引物 P2:5’ -TCAGAGASCCRTCRAAWCCAGAAA -3’，同时对鸭肝炎病毒I型和新血清型进行RT-PCR扩增，得到相应的目的片段，大小均为555bp ; (3)取PCR产物经XhoI酶切后进行RFLP分析:在所扩增的目的片段中仅鸭肝炎病毒新血清型可被Xho I酶切后经常规琼脂糖凝胶电泳检测片段为2段，大小分别为349bp和206bp，而鸭肝炎病毒I型的目的片段中不含被Xho I酶切位点，RT-PCR产物被Xho I酶切后经常规琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变，仍然是555bp。3.一种如权利要求1所述的引物在检测鸭肝炎病毒I型和新血清型试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种区别鸭肝炎病毒1型和新血清型的PCR-RFLP引物及其方法，所述引物为上游引物P1：5’-？CAATTGAGGACATGGCTAAGAAA-3’，下游引物P2：5’-？TCAGAGASCCRTCRAAWCCAGAAA？-3’，该方法是利用鸭肝炎病毒1型和新血清型基因编码区所含有的酶切位点差异来进行区别的，包括RNA的提取，RT-PCR扩增得到相应的目的片段后，XhoⅠ酶切后进行RFLP分析。本发明鉴定方法操作简单快速，准确率高。
【IPC分类】C12Q1/70, C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105132589
【申请号】CN201510655118
【发明人】万春和, 黄瑜, 施少华, 傅光华, 陈红梅, 程龙飞, 傅秋玲, 陈珍, 陈翠腾
【申请人】福建省农业科学院畜牧兽医研究所
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年10月12日