专利名称：鸭圆环病毒和鸭肝炎病毒二重pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鸭圆环病毒和鸭肝炎病毒二重PCR检测试剂盒。
背景技术：
鸭圆环病毒(DuckCircovirus, DuCV)和鸭肝炎病毒(DHV)均常见于鸭，鸭圆环病毒(DuCV)可造成鸭生长迟缓、羽毛凌乱、体重减轻等症状，可感染禽类的免疫系统，引起免疫抑制。鸭肝炎病毒(DHV)引起的鸭病毒性肝炎是一种可使病鸭高度致死的迅速传播的病毒性疾病，病程短且死亡快，死亡率可高达100%。这两种疾病流行广泛，传播迅速，发病率和死亡率高，易混合感染，目前对世界范围水禽危害较为严重，给养鸭业带来巨大的经济损失。鸭圆环病毒破坏病鸭的免疫系统，造成免疫抑制，鸭肝炎病毒流行广泛且高度致死，病鸭极易同时感染这两种病毒，一旦同时发生感染则会造成极大的损失。目前对DuCV和DHV 的鉴别诊断主要依靠传统的病原分离鉴定与血清学试验，但这些方法存在诊断时间长，特异性差，敏感性低，而且操作繁琐等的缺点，不利于快速诊断这两种疾病。PCR技术由于具有敏感性高、特异性好、快速、简便等特点，已经走进临床诊断实验室并广泛应用于各种禽病病原体的检测，包括用于DuCV和DHV的检测。二重PCR是一种特殊的PCR形式，其突出特点是，一次PCR反应，能同时检测并鉴别出两种病原体，在临床上具有很高的应用价值。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒的引物组。本发明提供的引物组，由引物I、引物2、引物3和引物4组成；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。上述引物组中，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为 2 2 (I. 5-2) (I. 5-2)；上述引物组中，所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比具体为 2:2:1.8 1.8。本发明的另一个目的是提供一种检测鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒的PCR试剂。本发明提供的PCR试剂，由上述的引物组、PCR缓冲液和水组成；所述引物组中的引物I在所述PCR试剂中的终浓度具体为2 μ mol/L ；所述引物组中的引物2在所述PCR试剂中的终浓度具体为2 μ mol/L ；所述引物组中的引物3在所述PCR试剂中的终浓度具体为I. 5-2 μ mol/L ；所述引物组中的引物4在所述PCR试剂中的终浓度具体为I. 5-2 μ mol/L ；所述引物组中的引物3在所述PCR试剂中的终浓度进一步具体为I. 8 μ mol/L ；所述引物组中的引物4在所述PCR试剂中的终浓度进一步具体为I. 8 μ mol/L。
本发明的第三个目的是提供一种检测鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒的PCR试剂盒。本发明提供的PCR试剂盒，包括上述的引物组或上述PCR试剂。上述的引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒产品中的应用也是本发明保护的范围。上述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒为用上述的引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒对所述待测样品进行二重PCR扩增。上述应用中，所述二重PCR扩增的退火温度为50°C -55°C，所述二重PCR扩增的退火温度具体为55で。本发明的第四个目的是提供一种检测鸭圆环病毒的引物对A。本发明提供的引物对A，由上述的引物组中的所述引物I和所述引物2组成；本发明的第五个目的是提供ー种检测鸭肝炎病毒的引物对B。本发明提供的引物对B，由上述的引物组中的所述引物3和所述引物4组成。上述的引物对A在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭圆环病毒产品中的应用也是本发明保护的范围；上述的引物对B在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭肝炎病毒产品中的应用也是本发明保护的范围。本发明的实验证明，本发明建立一次PCR反应就能同时检测和鉴别DuCV、DHV两种病原体的二重PCR技木，具有良好特异性，而且本试验在引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得该方法在结果判定时更简便、直观和实用。利用二重PCR—次可以扩增多个目的基因特点，一次PCR反应就可以检测多种病原体，这在临床应用中，对检测不同病原体感染，具有十分重要实用价值和实践意义。
图I为二重PCR的特异性试验图2为二重PCR的敏感性试验图3为二重PCR检测待测样本图4为鸭肝炎病毒其他PCR验证图5为鸭圆环病毒其他PCR验证
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的病毒、试剂具体如下实验菌株鸭圆环病毒(DuCV)记载在“广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查”，中国畜牧兽医，2010，37 (11) :156-158，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；鸭肝炎病毒为鸭I型肝炎病毒(DHV DAV2111株购自中国兽医药品监察所；对照菌(毒)株番鸭细小病毒(MDPV)记载在“广西番鸭细小病毒的分离和鉴定”，广西畜牧兽医，2002，18 (6) :5-7，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；小鹅瘟病毒记载在“小鹅瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立”，上海畜牧兽医通讯，2008，160 (06) :30-31，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；新城疫病毒记载在“新城疫植物油乳剂苗的研究”，中国预防兽医学报，2000，
(04):23-27，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；H9亚型禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”，中国人兽共患病学报，2006，(09) :858-860，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；试剂TIANamp Genomic DNA Kit 购自天根公司，AMV 反转录酶、Ribonuclease Inhibitor、dNTP购自TaKaRa公司。SPF鸡胚购自北京梅里亚公司。TRIzol LS Reagent购自Invitrogen公司。DU 800紫外分光光度计购自BECKMAN COULTER公司。实施例I、引物的设计和合成根据已发表鸭圆环病毒DuCV、鸭肝炎病毒DHV的基因文库，应用DNA Star软件， 设计针对DuCV和DHV基因序列的2对特异性引物，引物核酸序列见表I。引物由上海 Invitrogen公司合成。表I为DuCV和DHV弓丨物的核苷酸序列
权利要求
1.检测鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒的引物组，由引物I、引物2、引物3和引物4组成；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。
2.根据权利要求I所述的引物组，其特征在于所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为 2 2 (I. 5-2) (I. 5-2)；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比具体为2 2 1.8 1.8。
3.检测鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒的PCR试剂，由权利要求I或2所述的引物组、PCR缓冲液和水组成；所述引物组中的引物I在所述PCR试剂中的终浓度具体为2iimol/L ；所述引物组中的引物2在所述PCR试剂中的终浓度具体为2iimol/L ；所述引物组中的引物3在所述PCR试剂中的终浓度具体为I. 5-2umol/L ；所述引物组中的引物4在所述PCR试剂中的终浓度具体为I. 5-2 u mol/L ；所述引物组中的引物3在所述PCR试剂中的终浓度进ー步具体为I. 8 ii mol/L ；所述引物组中的引物4在所述PCR试剂中的终浓度进ー步具体为I. 8 ii mol/L。
4.检测鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒的PCR试剂盒，包括权利要求I或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂。
5.权利要求I或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂或权利要求4所述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒产品中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于所述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒为用权利要求I或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂或权利要求4所述试剂盒对所述待测样品进行二重PCR扩增。
7.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于所述二重PCR扩增的退火温度为50°C _55°C，所述二重PCR扩增的退火温度具体为 55。。。
8.—种检测鸭圆环病毒的引物对A，由权利要求I或2所述的引物组中的所述引物I 和所述引物2组成；或ー种检测鸭肝炎病毒的引物对B，由权利要求I或2所述的引物组中的所述引物3和所述引物4组成。
9.权利要求8所述的引物对A在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭圆环病毒产品中的应用；或权利要求8所述的引物对B在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭肝炎病毒产品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种鸭圆环病毒和鸭肝炎病毒二重PCR检测试剂盒。本发明提供了一种检测鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒的引物组，由引物1、引物2、引物3和引物4组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本发明的实验证明，本发明建立一次PCR反应就能同时检测和鉴别DuCV、DHV两种病原体的二重PCR技术，具有良好特异性，而且本试验在引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得该方法在结果判定时更简便、直观和实用。
文档编号C12Q1/68GK102605104SQ201210071889
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者刘加波, 庞耀珊, 范晴, 谢丽基, 谢志勤, 谢芝勋, 赵光远, 邓显文 申请人:广西壮族自治区兽医研究所