抗鸭肝炎病毒转移因子的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及兽药领域，更具体的说，是涉及一种抗鸭肝炎病毒转移因子的制备方法。
【背景技术】
[0002]鸭病毒性肝炎简称鸭肝炎，是由鸭肝炎病毒引起雏鸭的一种传播迅速和高度致死性传染病，是一种肝脏呈现出血炎症状态的急性烈性传染病。该病的主要特征为肝脏肿大呈斑点状出血，胆囊肿大，胆汁颜色变淡，有出血斑点和神经症状。在初次感染疫区，该病的死亡率很高，可达90%以上。
[0003]鸭病毒性肝炎主要发生于4?20日龄雏鸭，中成鸭一般不发病，鸡和鹅也不能自然发病。该病的主要传染源是病鸭和带毒鸭，主要通过消化道和呼吸道感染，饲养管理不良，如缺乏维生素和矿物质，鸭舍潮湿、拥挤等，均可促使本病发生。本病发生于雏鸭孵化季节，一旦爆发，传播很快，发病率可达100%，给养殖业带来了很大的经济损失。
[0004]转移因子(Transferfactor, TF)是T淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的可透析小分子物质-多肽核苷酸复合物，它能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体正常的淋巴细胞，从而增强受体的免疫功能，被誉为T细胞活性的触发剂、细胞免疫的增强剂、细胞免疫调节剂及干扰素产生启动剂。具有传递免疫信息、激发免疫细胞活性、调节免疫功能、增强机体特异性和非特异性细胞免疫功能等作用，可以抵抗真菌、病毒等非细菌性感染。TF含多种成分，分子量小，无热原，无抗原性，无毒副作用和无种属差异，是一种新型而又安全的免疫制剂。
[0005]目前转移因子的生产主要是通过半透膜透析得到，一次性生产量少，操作费用高，因此需要一种高效、快速、经济的方法来获取转移因子，进而实现转移因子的大规模工业化生产。除此之外，猪脾脏、胸腺以及淋巴结组织作为免疫活性细胞聚集的场所，且是活猪宰杀后的下脚料，成本较低而且材料来源非常广泛，因此从这类细胞中提取特异性转移因子，有重要的理论意义和现实意义。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种天然高效纯生物活性物质抗鸭肝炎病毒转移因子的制备方法。
[0007]本发明抗鸭肝炎病毒转移因子的制备方法，按照以下步骤进行:
[0008](I)制备病毒抗原:将鸭肝炎病毒接种于9-11日龄的鸡胚或鸭胚尿囊液中，330C _37°C温箱孵育，24h内死亡的鸡胚或鸭胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸡胚或鸭胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成悬液，-20°C—-40°C冰箱内保存备用；
[0009](2)提取病毒抗原:将步骤(I)中得到病毒抗原反复冻融3-5次后，装入厚壁小瓶子内，超声15-20min，4°C、5000rpm离心20_30min，弃去沉淀，收集上清液，将上清液经4°C、7000rpm离心20_30min,弃去沉淀，收集上清液,经4°C、25000rpm离心20_30min,弃去上清液，取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15 %、30 %、45 %、60 %及80 %的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4°C、15000-20000rpm离心2-4h，根据鸭肝炎病毒的分子量确定鸭肝炎病毒所在位置，吸出并置于-20°C—-40°C冰箱内保存备用；
[0010](3)用步骤(2)所得提取的病毒抗原免疫猪:挑选健康免疫猪，取制备的病毒抗原，采用皮下多点免疫方法，注射免疫猪，共免疫3-4次，前两次分别以完全佛氏佐剂及不完全佛氏佐剂混合抗原，以高速组织匀浆机打匀，在动物皮内或皮下多点注射免疫，第3次和第4次后在动物的肌肉或静脉注射，每次免疫间隔一周，最后一次免疫7-10天后取动物静脉血，以免疫荧光方法或ELISA方法检测上述病毒的特异性抗体效价，出现病毒特异性免疫效价后，宰杀动物，取脾脏和胸腺于冰上，转移至_20°C—-40°C保存，备用；
[0011](4)从免疫猪中提取抗鸭肝炎病毒转移因子:
[0012]①原材料的制备及预处理:取步骤(3)所得的接种鸭肝炎病毒免疫猪的脾脏、胸腺及淋巴结组织，用冷三蒸水洗净猪的脾脏，去除表面筋膜、脂肪等组织，再灭菌生理盐水反复冲洗；
[0013]②破碎:将洗干净的猪脾脏剪碎，加入2倍体积的冷生理盐水，在冰冻的条件下用高速组织捣碎机以1000r/min捣碎3次,每次3min,制得勻衆液；
[0014]③冻融:将匀浆液置于_80°C快速冷冻，水浴30°C中融化，交替冻融4-8次，每次融化后均以组织匀浆机高速匀浆粉碎；
[0015]④提取:加入3倍体积的冷生理盐水，置于冰冻离心机于5°C以4000r/min离心30min，取上层血红色液体，再用G2砂心漏斗过滤，取滤液；
[0016]⑤超滤:将上述滤液用截流值为5000道尔顿的中空纤维超滤膜加压超滤，滤液为分子量小于5000道尔顿的转移因子；
[0017]⑥除菌:将超滤得到的滤液用孔径为0.1-0.22um的滤膜加压过滤除菌；
[0018]⑦分装:4°C密封保存，即得抗鸭肝炎病毒转移因子提取液成品。
[0019]本发明的优点及有益效果是:
[0020]1、原材料来源丰富、无污染、成本低。猪脾脏、胸腺以及淋巴结组织属于屠宰后猪的下脚料。
[0021]2、破碎组织后，加入低温冻融处理的步骤，特别是在37°C以下溶解，不使小分子物质活性丧失，并能够使鸭肝炎病毒转移因子得以充分地提取。
[0022]3、工艺采用了比较先进的中空纤维超滤膜超过滤法，从而缩短了制备时间，保证物质分离过程中活性不被破坏。
[0023]4、提取物经生化测定和若干成分分析，是一种低分子量多肽-核苷酸复合物，是一种不含蛋自质、可溶的小分子物质，平均分子量在5000道尔顿以下。经体内外生物活性试验以及药理、毒性试验等证明，具有纯度高、免疫活性强、起效快而维持时间长、易吸收、无任何不良反应等特点，其疗效确切，安全可靠，既可治疗又可增强抗病能力。该提取物可做成口服液或注射液等剂型，便于应用。
[0024]本发明的抗鸭肝炎病毒转移因子可以有效的抑制鸭肝炎病毒，能保护正常机体细胞免受病毒感染。因此使用本发明的转移因子可以起到预防鸭肝炎病毒感染、能够保护正常机体细胞免受鸭肝炎病毒侵害的作用，从而降低发病率。同时对于遭到鸭肝炎病毒感染的鸭使用转移因子进行治疗，可有效的改善临床症状，提高治愈率、降低死亡率。
【具体实施方式】
[0025]本发明通过以下实施例进一步详述。需要说明的是:下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0026]实施例1
[0027]—种抗鸭肝炎病毒转移因子的制备方法，其步骤如下:
[0028](I)制备病毒抗原:将鸭肝炎病毒接种于10日龄的鸡胚尿囊液中，37°C温箱孵育，24h内死亡的鸡胚弃去，120h后收集有明显痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，置于组织匀浆机内制成悬液，-20°C冰箱内保存备用；
[0029](2)提取病毒抗原:将步骤(I)中得到病毒抗原反复冻融3次后，装入厚壁小瓶子内，超声20min,4°C、5000rpm离心30min,弃去沉淀，收集上清液,将上清液经4°C、7000rpm离心20min,弃去沉淀,收集上清液,经4°C、25000rpm离心30min,弃去上清液,取沉淀，用等体积PBS溶液溶解。将上述溶液装入以15 %、30 %、45 %、60 %及80 %的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管，超速离心，4°C、ISOOOrpm离心4h，根据鸭肝炎病毒的分子量确定鸭肝炎病毒所在位置，吸出并置于-20°C冰箱内保存备用；
[0030](3)用步骤(2)所得提取的病毒抗原免疫猪:挑选健康免疫猪，取制备的病毒抗原，采用皮下多点免疫方法