专利名称：甲胎蛋白特异性转移因子的制备方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及转移因子的制备方法，尤其涉及甲胎蛋白特异性转移因子的制备方法，制成的制剂可在原发性肝癌的治疗及肿瘤辅助治疗中应用。
转移因子是存在于白细胞中一种可透析的免疫小分子肽和多核苷酸，能将供体的某种抗原特异性迟发超敏反应转移给受体。转移因子是细胞免疫激活剂，能特异性和非特异性地提高受体的免疫功能。转移因子介导淋巴细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用，可抑制或破坏肿瘤细胞的生长。它无种属特异性，可以在种属间传递，动物来源的转移因子可以用于人类。对牛、羊、鼠、猪等多种哺乳动物与人类的转移因子进行比较，均未发现较大差异。目前，临床上已有非特异性转移因子和乙肝特异性转移因子应用，有明确的疗效，同时未发现明显的不良反应。
转移因子依据其来源和免疫活性的不同，可以分成非特异性转移因子(NTF)和特异性转移因子(STF)。它们的根本区别是NTF来自健康正常人或动物的白细胞、脾脏及淋巴组织；而STF来源于用抗原物质免疫过的人或动物的白细胞、脾脏及淋巴组织。肿瘤特异性转移因子作为一种细胞免疫因子，成功地成为一些肿瘤免疫治疗的有效制剂。临床前动物实验及临床资料表明，STF具有抑制杀伤癌细胞作用，可用于肿瘤辅助治疗。对于早期肿瘤术后病人，可以阻止肿瘤复发及转移；对已有转移的病人，可抑制肿瘤生长速度，延长患者生存期，是高新生物技术治疗肿瘤的比较成熟的项目。
本发明方法包含以下几个步骤(1)免疫抗原制备，将甲胎蛋白与福氏完全佐剂混合制成免疫原。
(2)甲胎蛋白免疫动物，包括免疫猪、羊或者其他动物，免疫程序按常规的动物免疫程序。
(3)动物免疫后收集经免疫动物的脾脏、白细胞，获得特异性转移因子。
本发明方法的免疫抗原的制备方法包含以下几个步骤(1)福氏完全抗原制备羊毛脂15g液体石蜡油85ml研匀后高压30分钟，取上述不完全佐剂1ml+BCG1mg即成福氏完全抗原。
(2)免疫抗原制备取甲胎蛋白1ml(含20ug)加福氏完全佐剂1ml.先将佐剂置于无菌玛瑙研钵，边研磨边滴加抗原，直至滴在水面不散开为止，形成油包水制剂。
本发明免疫动物的方法包含以下几个步骤(1)第一次免疫抗原2ml于动物如四肢、腋窝、腹股沟、国窝等处皮下多点注射，每点0.2ml，间隔10天。
(2)第二次免疫抗原1ml于相近部位皮下多点注射，每点0.2ml，间隔10天。
(3)第三第四次免疫同第二次。
本发明方法是采用反复冻融法提取转移因子，并对其的理化特性和免疫学活性进行鉴定。用该方法制备的甲胎蛋白转移因子具有强大的免疫调节功能，制成的制剂可在原发性肝癌治疗及肝癌的辅助治疗中应用。
运用本发明方法获得的甲胎蛋白特异性转移因子，制剂形式主要为注射制剂和口服制剂。
本发明具有的优点特异性转移因子(STF)是细胞免疫信息传递物，存在于抗原致敏的白细胞中，它能促进淋巴细胞DNA、RNA和蛋白质合成，可显著提高淋巴细胞对表达该抗原的特异性细胞免疫反应，有效地抑制相应肿瘤细胞DNA、RNA及蛋白质的合成，从而达到抑制或杀伤瘤细胞的作用，其作用明显优于非特异性转移因子。是目前国内外继外科手术、化疗和放疗治疗肿瘤的后的又一种有效方法。
目前的研究表明，特异性转移因子在肿瘤、AIDS、各种病毒感染等方面已取得明显优于非特异性转移因子的效果。患者应用肿瘤特异性STF，能明显提高患者自身的免疫力、杀灭扩散的肿瘤细胞、延长术后存活串、减轻因化疗和放疗引起的付作用，保护白细胞不明显下降，减轻疼痛，增加食欲，预防感冒等作用。STF已用于多种肿瘤的免疫辅助治疗，井获得了良好的效果。
目前临床上尚无AFP特异性转移因子的应用。用本发明方法获得的AFP特异性转移因子，制成的制剂可在原发性肝癌治疗及肝癌的辅助治疗中应用。
实施例1本发明甲胎蛋白特异性转移因子的一种制备方法1、免疫抗原制备(1)福氏完全抗原制备羊毛脂15g液体石蜡油85ml研匀后高压30’，取上述不完全佐剂1ml+BCG1mg即成福氏完全抗原。
(2)免疫抗原制备取甲胎蛋白1ml(含20ug)加福氏完全佐剂1ml.先将佐剂置于无菌玛瑙研钵，边研磨边滴加抗原，直至滴在水面不散开为止，形成油包水制剂。2、免疫程序取健康猪(50公斤左右)。
(1)第一次免疫抗原2ml于猪四肢、腋窝、腹股沟、国窝等处皮下多点注射，每点0.2ml，间隔10天。
(2)第二次免疫抗原1ml于相近部位皮下多点注射，每点0.2ml，间隔10天。
(3)第三第四次免疫同第二次。
于每次免疫后十天即下次注射时取血，测抗体效价。3、TF提取工艺流程1.取脾→水洗净→取脂肪及包膜→称体重→剪碎→加双倍量冷却无菌蒸馏水→捣碎(12000/分三分钟共2～3次)→置于无菌陶瓷容器内-40度过夜→次日取出流水融化→再置-40度过夜→次日取出融合→反复冻融4～5次；2.离心4000转/分×30分钟→取上清液→超滤(中空纤维柱代替)；3.超滤液微孔滤膜除菌过滤；4.无菌分装每支2ml。
实施例2甲胎蛋白特异性转移因子的部分应用1.应用本发明方法获得的甲胎蛋白特异性转移因子，能显著缩小荷肝癌小鼠的肿瘤大小，延长动物模型的生存时间。
2.运用该发明专利技术获得的甲胎蛋白特异性转移因子，可以制成注射制剂和口服制剂，用于原发性肝癌的治疗，具有极大的社会效益和经济效益。
本发明涉及的部分参考文献(1)熊正文，李春光。转移因子与肿瘤特异性转移因子的临床应用现状与展望。中华临床医药杂志2001；2(10)55-57(2)王威廉，陈心秋，周德南等。特异性转移因子对卵巢癌患者淋巴细胞转化和白细胞粘附抑制试验的影响。河南肿瘤学杂志2002；15(4)235-236(3)邓健蓓。特异性转移因子对人胃癌细胞RNA合成及Ha-ras癌基因表达的影响。中国免疫学杂志1990；6(3)161-163(4)李丛壁，方天祺。特异性转移因子的免疫活性及临床应用。中国生化药物杂志1994；15(1)70-73(5)彭贵勇，袁爱力，蔡景修等。肝癌特异性转移因子对IL-2活性及IL-2R表达的影响。中华肿瘤杂志1993；15(6)435-437(6)许卫民。特异性转移因子对人AFP促进小鼠H22腹水肝癌细胞RNA合成的拮抗效应。中国肿瘤临床1993；(12)897-900(7)许卫民。特异性转移因子对人AFP抑制鼠脾淋巴细胞生长的拮抗效应。中国免疫学杂志1991；7(4)235-237(8)徐扬。特异性转移因子对小鼠H22腹水肝癌细胞RNA合成的影响。中国免疫学杂志1988；4(1)14-18(9)朱斌。特异性转移因子对小鼠H22腹水癌细胞DNA合成的抑制作用。中国免疫学杂志1987；3(4)214-217本发明提及的所有文献都在申请中引用作为参考，就如同每一篇文献都被单独引用作为参考那样。此外应理解，本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.甲胎蛋白特异性转移因子的制备方法，其特征是用胚胎肝脏提取甲胎蛋白或用基因工程表达的全长或部分片段的甲胎蛋白免疫动物，收集经免疫动物的脾脏、白细胞，经分离获得特异性转移因子。
2.如权利要求1所述的甲胎蛋白特异性转移因子的制备方法，其特征是该方法主要包含以下几个步骤(1)先进行免疫抗原制备，将甲胎蛋白与福氏完全佐剂混合制成免疫原。(2)甲胎蛋白免疫动物，包括免疫猪、羊或者其他动物。(3)动物免疫后收集经免疫动物的脾脏、白细胞，分离获得特异性转移因子。
3.如权利要求2所述的免疫抗原的制备方法，其特征是该方法包含以下几个步骤(1)福氏完全抗原制备羊毛脂15g液体石蜡油85ml研匀后高压30分钟，取上述不完全佐剂1ml+BCG1mg即成福氏完全抗原。(2)免疫抗原制备取甲胎蛋白1ml(含20ug)加福氏完全佐剂1ml。先将佐剂置于无菌玛瑙研钵，边研磨边滴加抗原，直至滴在水面不散开为止，形成油包水制剂。
4.如权利要求2所述的免疫动物的方法，其特征是该方法包含以下几个步骤(1)第一次免疫抗原2ml于动物如四肢、腋窝、腹股沟、国窝等处皮下多点注射，每点0.2ml，间隔10天。(2)第二次免疫抗原1ml于相近部位皮下多点注射，每点0.2ml，间隔10天。(3)第三第四次免疫同第二次。
5.如权利要求2所述的转移因子的制备，其特征是采用反复冻融法提取转移因子，并对其的理化特性和免疫学活性进行鉴定。
6.如权利要求1所述的甲胎蛋白特异性转移因子的制备方法，其特征是用该方法制备的甲胎蛋白特异性转移因子，制成的制剂在原发性肝癌治疗及肝癌的辅助治疗中的应用。
7.如权利要求1所述的甲胎蛋白特异性转移因子的制备方法，其特征是获得的甲胎蛋白特异性转移因子制成的制剂形式，主要为注射剂和口服剂。
全文摘要
本发明提供一种甲胎蛋白特异性转移因子的制备方法，是用胚胎肝脏提取的或基因工程表达的全长或部分片段的甲胎蛋白用胚胎肝脏提取的或基因工程表达的全长或部分片段的甲胎蛋白免疫动物，收集经免疫动物的脾脏、白细胞，经分离获得特异性转移因子。用该方法制备的甲胎蛋白转移因子具有强大的免疫调节功能，制成的制剂可在原发性肝癌治疗及肝癌的辅助治疗中应用。运用本发明方法获得的甲胎蛋白特异性转移因子，其制剂形式可以是注射制剂和口服制剂。
文档编号C07K16/18GK1460686SQ0312931
公开日2003年12月10日 申请日期2003年6月12日 优先权日2003年6月12日
发明者陈智, 朱海红, 周林福 申请人:浙江大学