儿茶酚胺免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及儿茶酪胺免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体 和检测试剂及制备方法。
【背景技术】
[000引儿茶酪胺（catecholamine)是一类由酪氨酸衍生而来，含有儿茶酪和胺基的小分 子物质的统称，常见的儿茶酪胺类物质主要包括肾上腺素（epine地rine，E)、去甲肾上腺素 (nor巧in巧虹ine,肥）和多己胺（dopamine,DA)等（结构式如式1所示）。在人体内，儿茶 酪胺类物质主要由肾上腺髓质和交感神经元的嗜铭细胞所分泌，作为一类重要的神经递质 和激素，在人体中具有重要的生理作用，对屯、血管系统、神经系统、内分泌腺、肾脏、平滑肌 等组织器官具有广泛的调节作用。其中多己胺在大脑和神经信号传导中起着十分重要的作 用，可W提高神经系统反应速度，增强机体适应环境的能力。
[0003]多种疾病会导致儿茶酪胺类物质的分泌和代谢异常，如嗜铭细胞瘤、副神经节瘤、 神经母细胞瘤和肾上腺髓质增生等疾病。该些疾病患者体内儿茶酪胺的浓度会发生异常变 化，进而影响与儿茶酪胺相关生理功能的正常实现。此外，体液中儿茶酪胺水平还与高血 压、更年期综合征等有着密切的关系。因此，检测血浆和尿液中儿茶酪胺类物质的浓度对于 该些疾病的临床诊断和治疗W及药物药理作用的研究均具有重要意义。
[0004]
【主权项】
1. 一种儿茶酚胺免疫原，其结构式如式（I)所示：
式中，R为连接基团-(CH2)n-C00-，n是1至20之间的整数；载体为具有免疫原性的蛋 白质或多肽，选自血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白中的一种。
2. -种如权利要求1所述的儿茶酚胺免疫原的制备方法，其特征在于包含以下步骤： ⑴将载体蛋白200mg溶解于50ml0? 2M，pH8. 5的磷酸缓冲液中； (2) 将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg儿茶酚胺衍生物、3. 5ml二甲基甲 酰胺、3. 5ml乙醇、7. 0ml10mM，pH5. 0的磷酸钾缓冲液、200mg1-乙基-3-(-3-二甲氨丙 基）碳二亚胺、50mgN-羟基硫代琥珀酰亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30min; (3) 将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2~8°C下搅拌过夜，得到抗原；将合 成好的抗原经过透析进行纯化，得到儿茶酚胺免疫原。
3. -种儿茶酚胺衍生物，结构式如式（II)所示：
上述R为连接基团-(CH2)n-C00-，n为1至20之间的整数。
4. 根据权利要求3所述的儿茶酚胺衍生物的制备方法，其特征在于，取n= 3时，儿茶 酚胺衍生物的合成步骤如下：
或者，当n为3以外的其余整数时，儿茶酚胺衍生物的合成步骤与上述合成步骤的区别 仅在于：由化合物2合成化合物3的步骤中，采用的原料4-溴丁酸乙酯替换为2-溴乙酸乙 酯、3-溴丙酸乙酯或其余类似物。
5. -种抗儿茶酚胺特异性抗体，由权利要求1所述的儿茶酚胺免疫原免疫实验动物后 产生的完整抗体分子，或者为保留与儿茶酚胺特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物。
6. 根据权利要求5所述的一种抗儿茶酚胺特异性抗体，其特征在于所述的完整的抗体 分子、抗体片段或抗体衍生物，为采用单一的儿茶酚胺免疫原对动物加强免疫所获得的多 克隆抗体，或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；所述的实验动物为兔、山羊、小 鼠、绵羊、豚鼠或马的一种。
7. -种如权利要求5或6所述的抗儿茶酚胺特异性抗体的制备方法，其特征在于包含 以下步骤： (1) 用PBS将连接有牛血清白蛋白的儿茶酚胺免疫原稀释至1.Omg/ml，得到抗原溶液， 然后用1. 0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射； (2) 2~3周后，再用1. 0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物注射一 次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次； (3) 对步骤（2)的实验动物取血，分离纯化得到效价为1:30000-1:50000的抗儿茶酚胺 特异性抗体。
8. -种儿茶酚胺检测试剂，含有权利要求5或6所述的抗儿茶酚胺特异性抗体和指示 试剂，所述的指示试剂选自酶试剂；所述的酶试剂由儿茶酚胺酶标偶联物和酶的底物组成， 酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
9. 一种如权利要求8所述的儿茶酚胺检测试剂的制备方法，其特征在于包含以下步 骤： (1) 试剂A:将4. 036g、ll. 25mM氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和1. 711g、ll. 25mM葡 萄糖-6-磷酸用1L55mM、pH= 8. 0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将权利要求5-7 中任一项所述的抗儿茶酚胺特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗儿茶酚胺特异性抗体与 均相酶底物的体积比为1:100~1:10000 ; (2) 试剂B:将儿茶酚胺酶标偶联物加到120mM、pH= 8. 2的Tris缓冲液中，儿茶酚胺 酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100~1:10000。
10. 根据权利要求8所述的儿茶酚胺检测试剂的制备方法，其特征在于所述的儿茶酚 胺酶标偶联物的制备方法包含以下步骤： (1) 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：称取15mg规格为100KU的葡萄糖-6-磷酸脱 氢酶，室温溶解于 12mL含有 72.6mg0.05MTris、8mg3.3mMMgClJPlOOmgNaCl的溶液 中，pH= 9. 0 ;在溶液中加入225mg还原态的烟酰胺腺嗓呤二核苷酸、135mg葡萄糖-6-磷 酸以及0. 75mL卡必醇；再逐滴加入2mL二甲基亚砜； (2) 儿茶酚胺衍生物的激活：在无水状态下称取10mg儿茶酚胺衍生物，溶解于600yL 二甲基甲酰胺中；使上述溶液温度降到-2~-8°C;加入3yL三丁胺；加入1. 5yL氯甲酸 异丁酯；-2~-8°C搅拌30分钟； (3) 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与儿茶酚胺衍生物的连接：将步骤（2)激活的儿茶酚胺衍 生物溶液逐滴加入到步骤（1)溶解的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2-8°C搅拌过夜； (4) 纯化产物：通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8 °C下储存。
【专利摘要】本发明公开了一种儿茶酚胺免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法。本发明制备的儿茶酚胺免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗儿茶酚胺特异性抗体，并且与常见的62种药物无任何交叉反应；由该抗体制备得到的儿茶酚胺检测试剂，可以精确快速地确定样品中的儿茶酚胺含量。与市场上现有的检测试剂比较，本发明检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低儿茶酚胺检测成本，有利于临床大规模推广使用。
【IPC分类】C07K14-765, C07C213-02, C07K14-795, C07K16-44, G01N33-53, C07K14-435, C07C217-60
【公开号】CN104774256
【申请号】CN201510236349
【发明人】虞留明, 颜光涛, 洪天配, 邱玲
【申请人】苏州博源医疗科技有限公司
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年5月11日