海蜇来源的生物活性肽及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及从海蜜（化(9仍7細?<3escu7e/?加?Kishinouye)的蛋白酶解产物中分离 纯化具有1个新的生物活性肤，属于海洋生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 生物活性肤化iologicallyactivepeptide)是指对生物机体的生命活动有益或 具有生理作用的肤类化合物。生物活性肤的生物学意义主要体现在其吸收机制优于氨基 酸和具有氨基酸不可比拟的生理功能两个方面，其生理功能主要有类吗啡样活性、激素和 调节激素的作用，对生物体内的酶具有调节和抑制功能，免疫调节，抗血栓，抗高血压，降低 胆固醇，抑制细菌、病毒，抗癌等作用，抗氧化和清除自由基作用，改善元素吸收和矿物质运 输，促进生长，调节食品风味、口味和硬度等。因此，生物活性肤是药物筛选、制备疫苗和食 品添加剂的天然资源宝库。
[0003]海蜜（化(9仍7e曲<3 曲Kishinouye)属于根口水母目（化曲eae)，腔 肠动物，作为一种药食同源的大型水母，在我国有广阔的资源分布和悠久的应用历史，早在 一千六百多年前就已经开始为世人所食用。海蜜除食用外，全身均可入药，祖国医学认为 其性味咸平，入肺、肝两经，有润肺、化疲、止咳、清热、消食、润肠等功效。据李时珍《本草纲 目》所述，海蜜"气味咸温无毒、主治妇，入劳损、积血带下，小儿风疾丹毒，烫火伤"等，对气 管炎、哮喘、高血压、胃溃瘍、单纯性甲状腺肿大等症均有疗效。近年来我国医卫部口关于海 蜜的药用价值也有许多报道。认为对治疗高血压、慢性气管炎、哮喘、热疲咳嗽、胃溃瘍，单 纯性甲状腺肿和颈淋己结肿等，有一定疗效。尤其是海蜜的降压作用比较显著，药理研究证 明；海蜜蛋白酶解产物对肾动脉狭窄高血压模型动物具有明显的降压作用。海蜜主要是由 水，蛋白质、灰分、碳水化合物、脂肪等物质组成。近代研究分析表明：每100g海蜜食部中， 含水分65.0g，灰分18. 7g，蛋白质12. 3g，碳水化合物3.9g，脂肪0. 1g，巧182mg，铁 9. 5mg，硫胺素0.01mg，核黄素0.04mg，巧克酸0.2mg，胆固醇16mg。海蜜的许多药理 活性都与其所含蛋白有关，由此推测海蜜的蛋白酶解产物中可能存在一定数量的生物活性 肤。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供了一种海蜜来源的生物活性肤的制备方法。
[0005] 本发明从海蜜蛋白的酶解产物中分离纯化出1个新的生物活性肤，其序列分别为 Val-Gly-Pro-Tyr，药理学活性研究显示其体外具有较高的血管紧张素转化酶（AC巧抑制 活性，其ICs。为8. 40 + 0. 58uM，但不限于此； 1.海蜜蛋白酶解产物的制备 将=孤海蜜洗净除去泥沙等杂质，切块，加入10倍量水，浸泡5-6小时，用清水洗漆 后，重复上述操作S次，渐干后加适量水打浆，加水至10倍量，加入4% (W底物蛋白含量 计，w/w%)海产品水解专用酶（南宁东恒华道生物科技有限公司）调整抑至8. 0,温度55°C 水解4. 5h，100°C加热10min灭酶后，4000转/分离屯、15min,取上清液。
[0006] 采用分子量为5000化的超滤膜对上清液进行超滤处理，收集分子量小于5000Da 的部分，再进行纳滤处理脱盐，纳滤条件；分子量为150-300截留膜，进膜压力llBar，出 膜压力llBar。截留液进行冷冻干燥，冷冻干燥条件；温度控制条件；0-50min，(TC升至 20。[;50-300 111111，20。[;300-350 111111，20。[升至40。[;350- 750 111111，40。[;750-800 min，4(TC降至20°C;真空度为40pa，温度-30°C，最终得到海蜜蛋白酶解产物。
[0007] 2.生物活性肤的分离纯化 2. 1Se地adexLH-20凝胶色谱柱层析 取1中海蜜蛋白酶解产物蒸馈水溶解成200mg/ml溶液，Sephadex LH-20凝胶色谱柱 (2. 0cmX60cm)进行分离纯化，流动相为蒸馈水，洗脱速度为0.6ml/min，220皿测定吸 光度，收集各峰，冻干备用。
[0008]2.2高效液相色谱的分离纯化 用高效液相色谱进一步分离纯化。色谱条件如下；色谱柱为反相C18键合硅胶柱(WatersAtlantis,T3, 250mmX4.6mm, 5ym);流动相；A水，B己膳，梯度洗脱条件见 下表1。流速；1.0ml/min，柱温30°C，检测波长为220皿和280皿。收集主要色谱峰，冻 干备用得到短肤样品。
[0009] 表1高效液相色谱分离条件
【主权项】
1. 一种海蜇来源的生物活性肽，其特征是具有如下序列的短肽：Val-Gly-Pro-Tyr。
2. 根据权利要求1所述的一种海蜇来源的生物活性肽的制备方法，其特征是它包括 如下步骤：（1)海蜇蛋白酶解产物的制备；海蜇用海产品水解专用酶酶解，经超滤和纳滤 脱盐冻干得海蜇蛋白酶解产物；（2)生物活性肽的分离纯化；将海蜇蛋白酶解产物采用 SephadexLH-20凝胶色谱柱层析，高效液相色谱分离纯化得到一个新的四肽，体外活性显 示其具有较好的ACE抑制活性。
3. 根据权利要求2所述，其特征是所述海蜇蛋白酶解产物的制备包括如下步骤：将三 矾海蜇洗净除去泥沙等杂质，切块，加入10倍量水，浸泡5- 6小时，用清水洗涤后，重复上 述操作三次，沥干后加适量水打浆，加水至10倍量，加入4% (以底物蛋白含量计，w/w%)海 产品水解专用酶（南宁东恒华道生物科技有限公司）调整PH至8.0,温度55°C水解4.5h， 100°C加热10min灭酶后，4000转/分离心15min，取上清液； 采用分子量为5000Da的超滤膜对上清液进行超滤处理，收集分子量小于5000Da的 部分，再进行纳滤处理脱盐，纳滤条件：分子量为150 - 300截留膜，进膜压力11Bar，出 膜压力11Bar;截留液进行冷冻干燥，冷冻干燥条件：温度控制条件：0 - 50min，0°C升至 20°C;50 - 300min，20°C;300 - 350min，20°C升至 40°C;350 - 750min，40°C;750 - 800 min，40°C降至20°C;真空度为40pa，温度-30°C，最终得到海蜇蛋白酶解产物。
4. 根据权利要求2所述的一种海蜇来源的生物活性肽的制备方法，其特征是生物活性 肽的分离纯化包括如下步骤： (1) SephadexLH-20凝胶色谱柱层析； 取海蜇蛋白酶解产物用蒸馏水溶解成200mg/ml溶液，S印hadexLH-20凝胶色谱柱2. 0cmX60cm进行分离纯化，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.6ml/min，220nm测定吸光度，收 集各峰，冻干备用； (2) 高效液相色谱的分离纯化； 用高效液相色谱进一步分离纯化； 色谱条件如下：色谱柱为反相C18键合硅胶柱（WatersAtlantis,T3, 250mmX4. 6mm, 5ym);流动相：A水，B乙腈，梯度洗脱条件见下表1;流速：1.0ml/min，柱温30°C，检 测波长为220nm和280nm，收集主要色谱峰，冻干备用得到短肽样品。
【专利摘要】一种海蜇来源的生物活性肽及其制备方法，属于海洋生物技术领域。本发明从海蜇的蛋白酶解产物中分离纯化制备得到1个新的含有4个氨基酸序列的短肽，其序列鉴定为Val-Gly-Pro-Tyr，体外活性显示具有较好的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性。本发明旨在为海蜇资源的开发和利用提供理论依据。
【IPC分类】A61P35-00, C07K1-20, C07K14-47, C12P21-06, C07K1-34, A61K38-17, C07K1-36
【公开号】CN104774255
【申请号】CN201510174322
【发明人】刘新, 张绵松, 杨子君, 袁文鹏, 夏雪奎, 张永刚, 贾爱荣, 史亚萍, 齐君, 乔若瑾, 唐炜, 刘昌衡
【申请人】山东省科学院生物研究所
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月14日