改进的生物活性肽生产的制作方法

专利名称：改进的生物活性肽生产的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物活性肽的生产。
背景技术：
高血压是人中相对常见的疾病状态，其代表了心血管疾病、肾衰竭和中风的主要 风险因素。大量制药产物(例如钙阻断剂、β阻断剂、利尿剂、α阻断剂、中枢α拮抗剂、 血管紧张素II拮抗剂和ACE抑制剂)的可利用性表示高血压的生理机制是多方面的。在高血压的生理机制中，肾素_血管紧张素机制特别受到了大量科学关注。在这 一机制中，血管紧张素由肝分泌，并被肽酶肾素切割得到无生物活性的十肽——血管紧张 素I。当血管紧张素I经过肺毛细管时，被称作血管紧张素转化酶(下文称作ACE)的另一 肽酶通过去除血管紧张素I的最后两个残基(His-Leu)作用于血管紧张素，形成八肽血管 紧张素II。血管紧张素II八肽显示强血管收缩活性，并因此提高血压。导致更低的血管紧 张素II水平的ACE抑制预防血管收缩，因此预防血压高。除了切割血管紧张素I以外，ACE还能够水解缓激肽——也参与血压调节的一种 九肽。在后一机制中，ACE抑制导致提高的缓激肽水平，这促进血管舒张并且降低血压。因 此，抑制ACE通过至少两种独立的机制导致降血压效应。还已知八肽血管紧张素II刺激肾上腺皮质对醛固酮的释放。醛固酮的目标器官 是肾，在那里醛固酮促进肾小管对钠的提高的重吸收。ACE抑制还通过该第三机制降低血 压，但是在这种情况下通过减小钠的重吸收来实现。因为具有多重生理学效应，所以抑制ACE的蛋白水解活性是压制血压的一种有效 方式。该观察结果导致大量有效的制药降血压产物例如卡托普利和依那普利(Ondetti， Μ. Α.等，1977，Science, Washington DC, 196，441-444)。因为高血压是相对常见的疾病状态，所以用具有轻度活性的天然成分、特别是能 够加入食物或饮料产物中的具有轻度活性的天然成分来抵抗现代生活方式的这一不想要 的结果会是有利的，因为这类产物可以被常规消耗。或者可以将这类有轻度活性的天然成 分加入饮食补充物中。在最近数十年间发现，经发酵的奶中存在的特定肽具有ACE抑制能 力，并且能够在高血压受试者中诱导血压降低。目前大量体外和体内试验证明了从多种蛋 白质来源获得的不同肽的ACE抑制效应。尽管体外ACE检验揭示了许多不同的肽序列，但 是必须强调，ACE抑制肽需要在血中循环来发挥体内效应。这意味着有效的ACE抑制肽应 当抵抗胃肠蛋白水解消化系统的降解，并且应当在随后沿肠壁转运时保持完整。多种ACE抑制肽的结构_功能研究表明，它们通常在C-端序列中具有Pro-Pro、 Ala-Pro 或 Ala-Hyp(Maruyama, S.and Suzuki, H. , 1982 ；Agric Biol Chem. ,46(5) 1393-1394)。该发现部分通过下述事实解释ACE是不能切割涉及脯氨酸的肽键的肽基二 肽酶(EC3. 4. 15. 1)。因此不能从具有结构Xaa-Pro-Pro的三肽中去除二肽Pro-Pro，因为 Xaa-Pro键不能被切割。因此可以想象，如果以相对高的浓度存在，则具有Xaa-Pro-Pro结 构的三肽会抑制ACE活性。因为不仅ACE，而且几乎所有的蛋白水解酶在切割Xaa-Pro或 Pro-Pro键时都有困难，所以肽羧基端(多个)脯氨酸残基的存在导致分子相对抗蛋白酶的观点几乎是不证自明的。类似地，含有羟基脯氨酸(Hyp)来代替脯氨酸的肽是相对抗蛋白 酶的。藉此可以推断，在羧基端带有一个或多个(羟基)脯氨酸残基的肽可能在胃肠道中 逃脱蛋白水解降解。这些结论会帮助我们理解特定ACE抑制肽可观的体内降血压效应它 们不仅满足ACE抑制的结构需要，而且抵抗胃肠蛋白水解消化系统的降解，并且在随后在 肠壁上转运期间保持完整。已报道了三肽 Leu-Pro-Pro (LPP JP02036127)、Val-Pro-Pro (VPP ；EP 0583 074) 和 Ile-Pro-Pro (IPP J. Dairy Sci.，78 :777_7831995)的强 ACE 抑制活性。最初所有 ACE抑制肽以它们对ACE活性的体外影响为基础表征，三肽11 e-Pro-Pro (hereinafter referred to as IPP)Val-Pro-Pro (hereinafter referred to as VPP)and Leu-Pro-Pro (hereinafter referred to as LPP)因为强 ACE 抑制效应导致相对低的 IC50 值而突出。随后可以在自发性高血压大鼠中证实三肽VPP以及IPP的推测的抗高血压效 应(Nakamura等，J. Dairy Sci.，78 12531257 (1995))。在这些实验中，抑制性三肽来自 于经乳酸细菌发酵的奶。在奶发酵期间，期望的肽由生长的乳酸细菌所生产的蛋白水解酶 (proteinase)生产。该发酵途径的一个缺点是乳酸细菌是这样一种生物，其生产的酶的种 类和数量难以控制。因此ACE抑制肽的生产几乎不可再现，也不太可能生产最佳的酶集合 来确保需要的肽的最大产率。需要的发酵时间相对较长，这与低产率组合在一起，意味着生 物活性肽的不良的成本结构。尽管具有这些缺点，但是若干经发酵的奶制品已被介绍为健 康食物产品，所述健康食物产品加入预防高血压的天然的生物活性肽。另外，ACE抑制肽已 在电渗析、中空纤维膜透析或色谱方法后从经发酵的奶制品中浓缩，使其能够以浓缩的饮 食补充物如片剂或锭剂的形式销售。发酵生产途径的上述缺点在例如专利申请WO 01/68115、EP 1 231279、WO 06/67163和WO 07/013426中被描述。在WO 06/67163中描述了从乳酪蛋白中回收三肽 Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro或Leu-Pro-Pro的纯酶促工艺。本申请要求保护用蛋白水解 酶和肽酶消化含乳酪蛋白的材料，通过中间产物肽生产这些三肽的方法。这些酶温育中的 每一个可耗时长达12小时，并且是在促进微生物污染物长出(outgrowth)的条件下进行 的。在用肽酶温育之前，优选地纯化中间产物肽，并且只有在中间产物肽的额外色谱纯化步 骤后才获得高的ACE抑制肽终浓度。在EP1908354中如下生产经发酵的奶首先用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或其它密 切相关的蛋白酶消化酪蛋白，然后使用乳酸细菌发酵。EP1908354的比较实施例7-9显示， 木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶的使用导致经发酵的奶制品有提高的VPP和IPP含量，而已知能 够生产VPP和IPP的其它Aspergillus酶导致降低的VPP和IPP含量。结论是只有在木瓜 蛋白酶和菠萝蛋白酶与生产VPP和IPP的Lactobacillus Helveticus 一起时才能够生产 大量的VPP和IPP，因为它们具有协同效应。W02004/098309 与 Aspergi 1 Ius oryzae 的酶制剂一起使用生产 VPP 和 IPP 的乳酸 细菌(Lactobacillus Helveticus)。W02004/098309公开了许多蛋白水解酶制剂不适合制 备具有高VPP和IPP含量的经发酵的奶制品。另外，发现有用的Aspergillus oryzae制剂 需要以以酪蛋白为基础2衬％到10wt%的量添加。在实施例中使用5wt%的酶，仅在实施例 13-15中酶量改变。使用多于时仅获得大于50% VPP或IPP的摩尔产率。另外， W02004/098309的经发酵的含有VPP和IPP的产物均具有至少37%的DH。通常，已知具有这类高DH的经水解的产物具有异味。另外，高DH与直接加入固体食物中的降低的适应性 相关，并且其较差的可口性产生严格的感官限制。因此存在对生产下述经发酵的奶制品的需要，所述经发酵的奶制品包含大量VPP 和IPP并且解决了现有技术工艺的问题。

发明内容
本发明涉及以高产率生产有生物活性的，优选ACE抑制性的三肽的工艺。根 据本发明的工艺包括与酶温育步骤组合的发酵步骤，所述发酵步骤中使用乳酸细菌或 Bifidobacterium，所述酶温育步骤中使用添加的蛋白酶，优选在蛋白酶或肽的氨基酸序列 中存在的脯氨酸羧基端处切割的内切蛋白酶，更优选脯氨酸特异性内切蛋白酶或脯氨酸特 异性寡肽酶，最优选脯氨酸特异性内切蛋白酶。优选地，脯氨酸特异性蛋白酶在肽或蛋白质 中存在的脯氨酸羧基端处切割肽和蛋白质。任选地，氨肽酶与脯氨酸特异性蛋白酶一起添 加。优选地，氨肽酶得自Aspergillus物种。酶温育可以在发酵过程之前进行，或者与发酵过程同时进行，或甚至在发酵过程 完成后进行。优选地，温育与发酵过程同时进行。在终产物中需要存在有活力的微生物的 应用中，例如在特定的酸奶或益生菌制剂中，酶温育优选地在发酵过程之前进行。根据本 发明，使用乳酸细菌或Bifidobacterium进行发酵。合适的乳酸细菌和Bifidobacteria W M zS^iifS Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus IMM Lactococcus ^lJ 禾中例如 Lactococcus lactis, Leuconostoc 物禾中，Pediococcus 物禾中，Streptocoocus 物禾中 以及 Bifidobacteria 白勺代表例如 Bifidobacterium animalis>Bifidobacterium brevis、 Bifidobacterium infantis 禾口 Bifidobacterium longum。本发日月白勺方法可用于生产 ACE-抑制性或抗高血压的三肽，以及免疫调节、抗氧化或抗微生物的肽。特别地，优选地生 产三肽IPP、VPP和LPP。通过组合根据本发明的发酵和酶，将发酵过程的优点(例如产生 口味、质感(texture)或益生菌活性)与生物活性三肽的生产成本有效地结合。因此，本发明提供了生产包含三肽IPP和/或三肽VPP的经发酵的奶制品的方法， 所述方法包括使用奶蛋白质作为起始材料，其中使用合适的乳酸细菌或Bifidobacterium 对所述奶蛋白质进行发酵步骤，并使用脯氨酸_特异性内切蛋白酶或脯氨酸特异性寡肽酶 进行酶温育步骤。本发明的方法产生具有大量IPP和/或VPP的经发酵的奶制品。有利地，在本发明的方法中使用0. 05衬％到1. 7wt% (以每份存在的奶蛋白质量 的酶蛋白质为基础)的脯氨酸特异性内切蛋白酶或脯氨酸特异性寡肽酶。优选地在本发明 的方法中使用0. Iwt %到1. 5wt%、最优选0. 2衬％到1. 3wt% (以每份存在的奶蛋白质量 的酶蛋白质为基础)的脯氨酸特异性内切蛋白酶或脯氨酸特异性寡肽酶。使用的氨肽酶的 量优选地少于5wt %，更优选地少于3wt %，最优选地少于Iwt % (以每份存在的奶蛋白质量 的酶蛋白质为基础)。发明详述目前可商业获得若干种经发酵的奶制品，其含有生物活性的ACE-抑制肽，例如三 肽 IPP (Ile-Pro-Pro)、LPP (Leu-Pro-Pro)和 VPP (Val-Pro-Pro)。尽管所有这些产物通过用 公知的乳酸培养物发酵奶制品来制备，但是典型地，获得的终产物含有的这些ACE-抑制性三肽的水平高度可变。ACE-抑制性三肽的这些可变水平导致不想要的产量损失，并且在使 用经发酵的产物作为终产物时，导致有广泛分歧的降血压效应。这类降血压效应可以根据 现有技术中明确的方法测试，使用高血压大鼠通过体内测试进行，或使用现有技术中已知 的方法通过测量它们抑制血管紧张素转化酶(ACE)的能力来体外测试。可变水平的ACE-抑 制性三肽和藉此产生的降血压效应可通过使用的含有起始材料的不同奶蛋白质、不同的发 酵条件和乳酸培养物的差异来解释。另外，形成的ACE-抑制性三肽的性质和量取决于在应 用的特定发酵条件下生产乳酸的细菌类型所表达的蛋白水解系统的特征。目前已知为了在 人中获得显著的降血压效应，必须消耗相对大量的三肽IPP、VPP或LPP。不幸的是，在发酵 过程期间获得这样高水平的这些三肽并不容易许多因素影响发酵过程的进程和使用的乳 酸细菌或Bifidobacteria对需要的蛋白水解活性的生产。已知生产乳酸的细菌生产大量不同的蛋白酶(参阅例如Savijoki等，Appl Microbiol Biotechnol (2006) 71 394-406)。从相关的蛋白质来源产生三肽 IPP、VPP 和 LPP 需要大量这些蛋白酶之间复杂的相互作用。另外，多种蛋白酶必须大量存在。含有逐渐酸 化的奶蛋白质的发酵液的相关酪蛋白级分的凝固会使这些三肽从酪蛋白中的释放和定量 回收进一步复杂化。因为这些复杂原因，很难以下述方式进行发酵，所述方式使得某些想要 的三肽以提高和可再现的量存在。也必须考虑发酵过程同样可为其它目的(如例如改善风 味形成、粘度、口感的多糖以及想要的益生菌(probiotic)或益生元(prebiotic)成分的生 产)服务的事实。如果这类额外的目标发挥作用，则在最大化ACE-抑制性三肽水平方面对 发酵过程的优化变得甚至更加复杂。我们目前惊讶地发现，将微生物发酵步骤与脯氨酸特异性内切蛋白酶对奶蛋白质 的处理组合可导致最终发酵产物中所选择的具有羧基端脯氨酸的ACE-抑制性三肽的含量 提高。我们发现甚至使用由于高蛋白水解能力而已知的培养物发酵的产物也可以被改进， 达到更高的三肽IPP、VPP和LPP水平。另外，我们发现根据本发明的方法以更加可再现的 方式导致这类更高的三肽水平。甚至通过使用不产生期望的ACE-抑制性三肽而是由于其 风味形成或益生菌品质而被选择的培养物，本发明的方法也会导致具有大量ACE-抑制性 三肽的产物。通过这种方式，针对例如风味、多肽或益生元或益生菌生产被优化的发酵方法 的优点可以与生产大量选定的ACE*抑制性多肽的能力组合。因此，本发明简单地通过将根 据本发明的酶步骤并入本发明方法中，使得经发酵的奶的商业生产者能够制造含有提高的 和标准化的生物活性三肽(例如IPP、VPP和LPP)量的产物。“肽”或“寡肽”在本文中被定义为通过肽键结合起来的至少两个氨基酸的链。术 语“肽”和“寡肽”被认为是同义词(如通常所认识的那样)，根据上下文需要，每个术语可 互换使用。“生物活性”肽表示能够在哺乳动物中调节生理过程的肽。用本发明的方法生产 的优选的生物活性肽是羧基端具有脯氨酸的肽。其它优选的生物活性肽是具有降血压效应 的肽。最优选的生物活性肽是IPP、LPP和VPP。“多肽”在本文中被定义为包含超过30个氨基酸残基的链。本文中所有(寡)肽和 多肽式或序列都是从左至右按照从氨基端到羧基端的方向书写的，与通常实践一致。本文 中使用的单字母氨基酸代码在本领域中是公知的，其可以在Sambrook，et al. (Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)中找至丨J。
奶蛋白质表示奶、脱脂奶、无脂肪奶、酪乳(butter milk)、酸奶、在水中溶解至期 望的蛋白质浓度的奶粉，还表示在水中溶解至期望的蛋白质浓度的酪蛋白酸盐，任选地，必 须理解，含有乳清蛋白的酪蛋白酸盐溶液或糖巨肽(GMP)溶液或这些成分的组合应被术语 奶蛋白质涵盖。经发酵的奶制品表示通过乳酸细菌或通过Bifidobacterium或通过这类菌株的 组合发酵的奶蛋白质。水解产物(或蛋白质水解产物或经水解的蛋白质)表示通过蛋白质的酶促水解形 成的产物，可溶于酸的水解产物是蛋白质水解产物的可溶级分，其在本文中也被描述为含 有可溶的含肽组合物或包含可溶肽的组合物，或蛋白质水解产物和可溶于酸的水解产物的 混合物。因此，水解产物是含肽组合物，并且在本发明的情况下是含有三肽IPP和VPP的组 合物。生物活性肽组合物表示通过本发明的方法(藉此在酶促水解和蛋白质的发酵后) 形成的产物。可溶于酸的生物活性肽组合物是生物活性肽组合物的可溶级分，其在本文中 也描述为可溶的含有生物活性肽的组合物或包含可溶的生物活性肽的组合物，或生物活性 肽组合物和可溶于酸的、生物活性肽组合物的混合物。对所有酶进行分类和命名的、来自IUMB的国际承认的体系包括蛋白酶。用于蛋 白酶EC号码的更新的IUMB文本可在互联网站点http //www. chem. qmw/ac. uk/iubmb/ enZyme/EC3/4/ll/找到。在该系统中，按照其催化单一反应的事实对酶进行定义。这具 有下述重要暗示若干种不同的蛋白质均被描述为同一种酶，而能催化超过一种反应的蛋 白质却被当作不止一种酶。该系统将蛋白酶分为内切蛋白酶和外切蛋白酶。术语“蛋白 酶”(protease)、“蛋白水解酶” (proteinase)和“肽酶”在本文中可互换使用。内切蛋白酶 是催化内部肽键水解的那些酶，外切蛋白酶则水解与末端a-氨基邻近的肽键(“氨肽酶”)， 或末端羧基与倒数第二个氨基酸之间的肽键(“羧肽酶”)。内切蛋白酶基于催化机制被分 为多个亚-亚组。存在有下述亚-亚组丝氨酸内切蛋白酶(EC 3. 4. 21)、半胱氨酸内切蛋 白酶(E.C 3. 4. 22)、天冬氨酸内切蛋白酶(EC 3. 4. 23)、金属内切蛋白酶(EC 3.4.24)和苏 氨酸内切蛋白酶(EC 3.4.25)。氨肽酶在3. 4. 11组中。亚分组基于除去20种不同氨基酸的相对效率。可区分开 具有窄的和宽的特异性的氨肽酶。氨肽酶可从蛋白质和肽底物顺序除去单个的氨基末端 氨基酸。具有窄特异性的氨肽酶展示出对于在Pi位置上从底物肽释放的氨基酸残基类型 的强烈偏好。宽特异性的氨肽酶能在N-末端或Pl位置释放一定范围的不同氨基酸(按 照 Schechter 的命名法Schechter，I. And Berger, Α. 1967. Biochem Biophys Res Commun 27:157-162)。羧肽酶能从蛋白质和肽底物顺序除去单个的羧基末端氨基酸。与内切蛋白 酶的情况相当，羧肽酶基于催化机制被分为多个亚-亚组。丝氨酸型羧肽酶处于EC 3.4. 16 组，金属羧肽酶处于EC 3.4. 17组，半胱氨酸型羧肽酶处于EC 3.4. 18组。针对蛋白酶的EC 表的值用于提供针对多种类型的蛋白酶活性的标准术语，尤其用于向每种蛋白酶分配独特 的身份号码以及推荐名称。WO 02/45524描述了能够得自Aspergillus niger的脯氨酸特异性内切蛋白酶， 其可有利地用于本发明中。衍生自A. niger的酶优先在脯氨酸的羧基端切割，但是也可以 在羟基脯氨酸的羧基端切割，并且以更低的效率在丙氨酸的羧基端切割。WO 2002/45524还教导了在该来自A.niger的酶和来自其它微生物或哺乳动物来源的已知的脯氨酰寡肽酶 之间不存在清楚的同源性。与已知的脯氨酰寡肽酶相反，A. niger酶具有酸性pH最适度。分 泌型A. niger酶似乎是丝氨酸肽酶的S28家族成员，而不是大部分胞质脯氨酰寡肽酶都归 入的 S9 家族(Rawlings，N. D. and Barrett, AJ. ；Biochim. Biophys. Acta 1298(1996) 1—3)。 优选地，衍生自A. niger的酶制剂作为纯净的酶使用。结果获得特征是脯氨酸含量非常高 的浓缩的ACE抑制性肽混合物。特别适合本发明的是下述酶，所述酶·具有脯氨酸_特异性内切蛋白酶活性和·具有与WO 2002/45523的SEQ ID NO :2相同的氨基酸序列，或具有与WO 2002/45523的SEQ ID NO :2的氨基酸1到526具有至少80%、优选至少90%氨基酸序列 同一性的氨基酸序列。氨基酸序列之间的同一性水平通过WO 2002/45523中第15页提到 的方法测定。WO 2006/005757中描述了氨肽酶从奶蛋白质中获得三肽IPP和VPP但不与发 酵步骤组合的用途。在WO 2006/005757中，提到了三种具有氨肽酶活性的商业酶制剂， 即 Flavourzyme 1000L (Novozymes，丹麦)、Sumizyme FP (Shin Nihon,日本)和 Corolase LAP Ch. :4123(AB Enzymes，UK)。所有这三种酶制剂得自 Aspergillus 物种。 已知Flavourzyme 和Sumizyme FP 二者是除了非特异性内切蛋白水解活性和羧肽水 解活性以外还含有若干氨肽水解酶活性的复合酶制剂。Corolase LAP代表一种相对纯净 的、克隆和过表达的亮氨酸氨肽酶活性。与脯氨酸-特异性内切蛋白酶组合时，所有三种提 到的酶制剂能够最大化从酪蛋白酸盐到降血压三肽IPP和VPP的产量。然而，同样可使用相 对富含氨肽水解活性的其它酶制剂，例如酶制剂如P印tidase 436P-P436P和P印tidase 433P-P433P，二者均可从Biocatalysts (Wales，UK)商业获得。另外，经克隆和过表达的氨 肽酶〃 ZBH"来自A.niger(见WO 02/068623的序列号57，本文中称作〃 ZBH")。还已知 氨肽酶由除Aspergilli之外的其它微生物生产，例如已知Bacilli和Lactobacilli生产 多种氨肽酶。然而，对根据本发明的方法而言，得自Aspergilli的氨肽酶是优选的。有效的ACE抑制性肽可能在肽的羧基端并入一个或两个脯氨酸残基。相同的结 构要求也孵育肽针对蛋白水解降解的提高的抗性，从而提高了完整的肽会在血流中终结的 可能性。为了获得在其羧基端具有至少一个但是优选多个脯氨酸残基的肽，使用能够在脯 氨酸残基的羧基端一侧切割的蛋白酶提供了一种有趣的选项。所谓的脯氨酰寡肽酶(EC 3. 4. 21. 26)具有优先在脯氨酸残基羧基侧切割肽的独特可能性。在所有从哺乳动物以及微 生物来源分离的充分表征的脯氨酸特异性蛋白酶中，鉴定了独特的肽酶结构域，其在酶的 活性位点处排斥大的肽。事实上，这些酶不能够降解含有多于约30个氨基酸残基的肽，从 而这些酶目前被称作“脯氨酸寡肽酶”(Fulop等Cell，Vol. 94，161-170，July 24，1998)。 因此，这些脯氨酰寡肽酶在展现其水解作用之前需要用其它内切蛋白酶彻底预水解。然而， 如TO 02/45523中所述，甚至脯氨酰寡肽酶与这类另一内切蛋白酶的组合也会导致下述水 解产物，所述水解产物的特征是具有羧基端脯氨酸残基的肽的比例显著提高。因此，这类 水解产物或经发酵的水解产物形成分离下述肽的极佳的起点，所述肽具有体外ACE抑制效 应以及改进的对胃肠蛋白水解降解的抗性。尽管有这些可能的益处，但是我们不知道有申 请阐述脯氨酸特异性蛋白酶与发酵过程组合用于回收ACE抑制性肽的用途，更不要说三肽IPP> VPP和LPP的选择性生产了。在发酵步骤中，可以根据本发明的方法使用许多工业利用或可商业获得的乳起 始培养物(dairy starter culture)和所谓的添加(adjunct)培养物。乳酸细菌包括 Lactobacillus 属的成员例如 Lactobacillus helveticus、Lactobacillus plantarum、 Lactobacillus rhamnosus禾口Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus,Lactococcus 例 如 Lactococcus lactis, Leuconostoc, Pediococcus 禾口 Streptocoocus。 来 自 Bifidobacterium和Lactobacillus的物种的微生物在益生菌制剂中频繁使用。乳酸细菌 的蛋白水解系统由与细胞壁结合的内切蛋白酶和大量不同的细胞内肽酶(包括内切肽酶) 和大量不同的氨肽酶(包括二-氨肽酶和三-氨肽酶)组成。非常令人惊讶的是乳酸细菌并 不利用羧肽酶。在奶发酵中用作起始物时，Iactobacilli的蛋白水解系统水解奶蛋白质，从 而在培养基中形成若干种类的肽。因为这些肽不全被细菌用于其生长，所以部分这些肽在 发酵期间累积。然而，已知蛋白水解能力在多种乳酸细菌间大幅变化(参阅例如Yamamoto 等，Biosci. Biotech. Biochem.，58 (4)，776-778，1994)。已知在传统发酵奶制品(例如瑞士 多孔干酪(Emmental cheese))的制造中广泛用作乳起始物的Lactobacillus helveticus 具有相对高的蛋白水解活性。现有技术涉及大量高度蛋白水解的Lactobacillus helveticus 菌株，例如 CNRZ 244(Centre National de recherches Zootechniques, Jouy-en-Josas,法国)、LKB-16H(US6890529)、 R211 和 R389(Institut Rossell, Montreal，加拿大)、CM4(US6534304)、JCM 1006 和 JCM1004(Japanese Collection of Microorganisms, Saitama,日本)、CHCC637 禾口 CHCC641 (Chr. Hansen Culture Collection, Horsholm，丹麦)。为了达到ACE-抑制性肽的可接受的水平，可要求Lactobacillus helveticus菌株具有异常高的蛋白水解活性。这类菌株的筛选已在大量出版物中报道。最 公知的 ACE-抑制性肽 Val-Pro-Pro (VPP) ,Leu-Pro-Pro (LPP)和 Ile-Pro-Pro (IPP)已在用 这类高度蛋白水解的Lactobacillus helveticus菌株发酵的奶中鉴定。另外，这类乳酸细 菌对免疫调节的、抗氧化和抗微生物的肽的生产以及这类乳酸细菌趋向于维持胃肠、粘膜 表面健康微生物区系的功能同样已被描述(http://en. wikipedia. org/wiki/Lactic acid bacteria)。属于Lactobacillus和Bifidobacterium属的细菌也被用作益生菌。益生菌 被定义为“以足量被使用时赋予宿主健康益处的活的微生物”。因此，益生菌制剂应当含有 大量有活力的微生物。在根据本发明的一个优选的申请中，通过中度热处理使添加的酶活 性失活。因为这样的热处理同样会使存在的微生物失活，显然对于益生菌产物或需要大量 有活力的Iactobacilli的其它产物而言，酶温育最好在微生物发酵之前进行。首先，在例 如本发明实施例3中所述条件下进行奶蛋白质的酶水解。然后通过温和的热处理(例如 120°C下热交换器中2到7秒)使酶失活，其中在冷却和任选地过滤后，可以用合适的益生 菌菌株接种液体，并培养直至获得益生菌产物所需的高滴度，典型地为每mllO9到IOki个菌 落形成因子(CFU)。这一途径的更详细的信息可参阅本申请的实施例5。尽管乳酸细菌生产许多种蛋白酶并且使用高蛋白水解性Iactobacilli进行降血 压肽的商业生产，但是我们发现在所述过程的酶处理期期间补充脯氨酸特异性蛋白酶(任 选地与氨肽酶组合)进一步提高ACE-抑制性肽IPP、VPP和LPP的产量。特别地，在目标是 产生益生菌活性的口味、质感的发酵过程中(其中使用具有有限的蛋白水解能力的乳酸细 菌或Bifidobacteria)，补充脯氨酸特异性蛋白酶(任选地与氨肽酶组合)会导致大幅增强
9的ACE-抑制性肽的水平。在本发明的一个实施方式中，氨肽酶与脯氨酸-特异性蛋白酶同 时添加，在另一实施方式中，使用氨肽酶的温育与使用脯氨酸-特异性蛋白酶的温育独立 完成。通常，使用氨肽酶的温育之前是使用脯氨酸-特异性蛋白酶的温育。奶发酵，特别是使用具有非最优的蛋白水解活性的乳酸细菌进行的奶发酵，容易 由于部分蛋白质水解而导致苦的异味。脯氨酸_特异性蛋白酶以及氨肽酶已被描述为最小 化这类苦的异味。因此，这些酶的使用可不仅导致增强的ACE-抑制性三肽水平，而且也可 有利地导致更少的苦味发酵产物。这类可能的苦味减少可展示于本发明的实施例5中。使用根据本发明的脯氨酸特异性蛋白酶的优点可以通过将在包含奶蛋白的发酵 液中培养的乳酸细菌或Bifidobacteria的发酵与用脯氨酸-特异性蛋白酶对该发酵液的 温育组合来获得。后一酶温育可以在发酵过程之前，或者可在发酵过程期间发生。因为优 选的脯氨酸_特异性内切蛋白酶有非常低的PH最适度，所以酶温育甚至可以在发酵完成后 进行，即在完全被酸化的发酵液中或已去除不溶物质(例如细菌或凝固的奶蛋白质)的完 全酸化的发酵液中进行。酶温育甚至可以在额外的发酵液浓缩步骤后发生。在所有这些过 程中，酶温育可导致高并且标准化的ACE-抑制性三肽水平。根据本发明的方法通常具有少 于24小时的酶温育时间，优选地，所述温育时间少于10小时，更优选地少于4小时。如果 酶温育与发酵步骤独立地完成，则温育温度通常在30°C和60°C之间，优选地高于30°C，更 优选地高于40°C，最优选地高于50°C。乳酸细菌或Bifidobacteria培养或发酵时间通常在3和30小时之间，优选地在 6和16小时之间。培养或发酵温度通常在20 V和42 V之间，优选地在25 V和38 V之间。 通常在发酵开始时，含有蛋白质的发酵液的pH在6和7之间。通常在发酵开始时，每ml 含蛋白质的发酵液中会存在优选地在IO5和IO9之间、更优选在IO5和IO7之间个乳酸细菌 (或Bifidobacteria)细胞。这些细菌通常得自用选择的乳酸细菌(或Bifidobacteria) 接种的预孵育培养基。在发酵结束时，细胞数典型地在IO8和IOltl细胞/ml之间。在乳制 品工业中，所谓的“起始”培养物主要负责奶的酸化。这类起始培养物的典型的例子包括 用于乳酷生产的Lactococcus lactis，禾口用于传统酸奶的Streptococcus thermophilus 和 Lactobacillus delbruckii subspecies bulgaricus。所谓的“添加”培养物在乳制品 工业中用于对终产物提供特定的属性，例如风味、质感或外观(eye-formation)。添加培养 物的典型例子是 Lactobacillus helveticus、Propionibacterium ssp 禾口 Lactobacillus acidophilus。胃用胃的胃舌 Lactobacillus reuteri、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus rhamnosus 禾口 Bifidobacterium ssp。推荐在每天的基石出上 消耗约IO9个这类益生菌培养物的有活力的细胞。在IPP和VPP的生产期间，有利地还形成ACE-抑制性三肽LPP。优选地，奶制品蛋 白质序列中存在的至少40%、更优选地至少50%、或进一步更优选地至少60%、最优选地 至少70%的-I-P-P-序列被转化为三肽IPP。优选地，蛋白质序列中存在的至少40%、更优 选地至少50%、或进一步更优选地至少60%、最优选地至少70%的-V-P-P-序列被转化为 三肽VPP。优选地，蛋白质序列中存在的至少40%、更优选地至少50%、或进一步更优选地 至少60%、最优选地至少70%的-L-P-P-序列被转化为三肽LPP。脯氨酸特异性蛋白酶优 选地能够水解大的蛋白质分子如多肽以及寡肽。除了涉及具有降血压活性的食物产品以外，本发明还涉及这些肽组合物用于制造
10营养药物(优选药物)，用于改善健康或预防和/或治疗疾病，或用于制造用于治疗或预防 血压高(高血压)、心力衰竭、前糖尿病或糖尿病、肥胖症、肾衰竭、血流循环收缩、葡糖耐量 受损或紧张的营养药物(优选药物)的用途。优选地，本发明的肽组合物以膳食补充剂的形 式，以个人护理应用(包括洗剂、凝胶或乳液形式的局部应用)的形式，或作为食物、饮料、 饲料或宠物食物成分而使用。本发明还公开了-适用于治疗高血压的肽组合物，其通过酸沉淀方法获得并得下述肽组合物，所述 肽组合物具有以干物质为基础15%到30% (w/w)、优选地高于18% (w/w)、更优选地高于 20% (w/w)的脯氨酸含量。-包含5到20mg/gVPP (基于干物质和基于蛋白质)，5到20mg/gIPP (基于干物质 和基于蛋白质)和任选地5到20mg/g LPP(基于干物质和基于蛋白质)的肽组合物，和-肽组合物，其包含15到50%(wt干物质)含有至少一个羧基端脯氨酸的肽，并 且包含至少5mg/g VPP (基于干物质和基于蛋白质)、至少5mg/g IPP (基于干物质和基于蛋 白质)和任选地至少5mg/g LPP(基于干物质和基于蛋白质)。另外，本发明涉及生产包含可溶肽的组合物的方法，所述可溶肽通过用脯氨酸特 异性蛋白酶将蛋白质水解至5-38%的水解度(DH)来生产。根据本发明，获得大量三肽IPP 和VPP的方法可以优选地在10和38之间的DH下、更优选地在15和35之间的DH下、最优 选地在20和30之间的DH下获得。本发明方法中使用的蛋白质优选地是奶蛋白质，更优选 地是酪蛋白或酪蛋白酸盐。因为已知钠在高血压中起作用，所以生产ACE抑制性肽的优选 的底物是这些蛋白质的铵盐、钙盐、镁盐和钾盐而不是钠盐。有利地，奶蛋白质在本发明的方法中使用之前不发酵，并且可以通过将脯氨 酸-特异性蛋白酶与氨肽酶组合来进行酶促处理。任选地，氨肽酶仅在隔离了经水解的蛋 白质的不溶部分之后添加。优选地，在选定的PH条件下将经水解的蛋白质的不溶部分与可 溶部分隔离。在EP 1 231 279中描述了从奶酪蛋白中回收三肽VPP和IPP的纯酶促的方法。 该申请要求保护通过用蛋白水解酶和肽酶消化含有奶酪蛋白的材料，经由所谓的“中间产 物肽”生产三肽的方法，所述“中间产物肽”选自由下述两种肽组成的组，第一种肽含有序 列Val-Pro-Pro但是除该序列中的Pro之外不含Pro，第二种肽含有序列Ile-Pro-Pro但 是除该序列中的Pro之外不含Pro。如EP 1 231 279的实施例中所述，所述方法涉及两步 骤的过程。首先生产包含Val-Pro-Pro或Ile-Pro-Pro的中间产物肽。这通过用根据实施 例之一的合适的蛋白水解酶在37°C下温育12小时来完成。然后通过将所述第一水解产物 在100°C下加热3分钟使所述蛋白水解酶失活，再次冷却后，添加另一酶制剂(事实上具有 外切蛋白水解活性的制剂)。在37°C下用这一其它酶制剂再温育12小时后，可以验证三肽 Val-Pro-Pro和Ile-Pro-Pro的存在。为了获得这些ACE抑制性肽的更高产量，EP 1 231279 还提出在与外切蛋白水解活性接触之前纯化并浓缩所述中间产物肽。EP 1 231 279还提 出在获得中间产物肽之后和将中间产物肽与肽酶接触之前，在程序中可任选地进行多种操 作，例如通过例如在5000到20000rpm下离心3到10分钟去除未反应的蛋白质。因此期望 的三肽在工业上相当难操作的两步骤酶促过程中获得。因为每次酶温育可在4. 5到7. O的 PH下和25°C到50°C的温度下耗时长达12小时，所以显然这一程序从微生物观点来看也是不可接受的。上述长的温育时间与25至50°C的低温育温度的组合可能容易导致含蛋白质 的溶液被感染。因此，根据本发明，不对中间产物加以纯化来生产生物活性肽如IPP和VPP。 EP 1 231 279描述了当用蛋白酶对奶蛋白进行消化时中间产物肽的形成，该中间产物肽除 了(分别地)Ile-Pro-Pro或Val-Pro-Pro之外不含Pro。随后，用另一种酶将该中间产物 肽分别转化为IPP或VPP。为了获得高产率，在转化为三肽之前用色谱对该中间产物肽进行 纯化。根据本发明，无需对中间产物肽进行纯化即可获得高产率。 在W007/013426中描述了用于生产ACE-抑制性肽VPP、IPP和YP的两步骤方法。 在这一途径中，通过将通过乳酸细菌的发酵过程与酶促温育组合最大化ACE抑制性肽的产 量。该酶温育可以在发酵过程之前或者与发酵过程同时进行。选择的酶是木瓜蛋白酶、菠 萝蛋白酶或与木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶具有相似活性的蛋白酶。基本上所有这些酶是属 于IUBMB种类EC 3. 4. 22的所谓的半胱氨酸蛋白酶。用这一具体类别的酶温育的目的是 促进奶蛋白质的分解，从而便于Iactobacilli生产的蛋白酶形成ACE-抑制性肽。通过比 较IPP和VPP的最终产量，这些半胱氨酸内切蛋白酶选自大量其它可商业获得的酶。半胱 氨酸内切蛋白酶因为它们广泛的切割特异性而已知，但是具有切割C-端氨基酸残基Arg， Lys, Phe and Tyr (“Zj^'O 白勺{i女子(Adler-Nissen, J. In Enzymatic Hydrolysis of Food Proteins,第一版；Adler-Nissen, J. , Ed. , Elsevier App1. Sci Publ. , London, UK, 1986)。重要的是注意，与根据本发明的脯氨酸-特异性蛋白酶不同，这些半胱氨酸内切蛋 白酶不具有或仅具有可忽略的切割脯氨酸残基C-端蛋白质或肽的能力。反之亦然，与半胱 氨酸内切蛋白酶不同，根据本发明的脯氨酸_特异性蛋白酶对切割Arg、Lys、Phe和Tyr残 基的C-端展示出可忽略的偏好。因此，根据本发明的方法区别在于脯氨酸_特异性内切活 性的活性，其为具有中性PH最适度的脯氨酸_特异性寡肽酶或是具有酸性PH最适度的脯 氨酸-特异性内切蛋白酶。在这两种情况下均可额外使用氨肽酶。来自A.niger的谷氨 酸-特异性内切蛋白酶的PH最适度在4. 3左右。因为该低pH最适度，所以用来自A. niger 的脯氨酰内切蛋白酶温育牛奶酪蛋白酸盐是不证自明的。另一方面，如果PH降至低于6. O 则牛奶酪蛋白酸盐会沉淀，在所述PH值下脯氨酸-特异性内切蛋白酶能够展开其完全活 性，底物沉淀并且不易被影响；另一方面，在高于6.0的pH值下，可以期望脯氨酸-特异性 内切蛋白酶被部分去稳定化，并且仅具有微小活性。在本文中我们展示，在两种相当不利的 条件下，用来自A. niger的脯氨酸-特异性内切蛋白酶温育可产生若干ACE抑制性肽或其 前题。根据本发明，ACE抑制性三肽IPP和LPP各自以对应于酪蛋白中理论存在量的至少 30%、有利地至少40%、更优选地至少50%的产量生产。本发明的另一方面是从奶蛋白质 水解产物中浓缩ACE抑制肽的方法。与W007/013426中遵循的途径不同，这样的奶蛋白质 水解产物优选地由非-半胱氨酸蛋白酶、更优选地由丝氨酸蛋白酶、进一步更优选地由脯 氨酸-特异性蛋白酶水解。半胱氨酸内切肽酶被理解为包括属于IUBMB种类EC 3. 4. 22的 所有酶。部分被根据本发明的脯氨酸_特异性蛋白酶水解的奶蛋白质会在所选择的PH条 件下沉淀。浓缩方法包括从发酵液中去除部分沉淀的经水解的蛋白质，从而将沉淀的蛋白 质与溶液中的ACE抑制肽隔离。在ACE抑制肽的有效和便利的回收的又一个实施方式中， 将发酵液的PH值调节为更中性的pH值，从而使形成的酪蛋白沉淀物部分再溶解，改进脯氨 酸-特异性蛋白酶的可用性并提高任选地添加的氨肽酶的效力。如本发明中所例证的，两 种效应均导致提高的ACE-抑制性三肽的产量。为了进一步优化得到的用于治疗遭受过高血压的个体的发酵液体，在随后的处理期间可以去除任何剩余的未溶解的物质，然后通过 例如纳米过滤处理来去除小分子如单糖、乳酸、钠和氯化物。需要时，可以用降血压离子如 钙、钾和镁补充纳米过滤的渗余物。虽然在乳酪制作工艺和乳酪熟化中使用了同样的原理(发酵与酶促处理组合) 来从乳清蛋白中分离酪蛋白凝乳，但在乳酪制作工艺中，仅使用天冬氨酸内切蛋白酶(EC 3. 4. 23)。该组酶包括公知的乳酪制作酶，例如凝乳酶以及多种胃蛋白酶，例如哺乳动物胃 蛋白酶以及多种微生物胃蛋白酶，例如曲霉胃蛋白酶(aspergillopepsins)以及毛霉胃蛋 白酶(mucorp印sins)。在本申请中，乳酪制作工艺中的凝乳生产或乳酪制作被定义为不被 本发明的方法包括。优选地，脯氨酸-特异性蛋白酶不含污染性的内切蛋白酶活性。任选地，氨肽水解 活性与脯氨酸特异性蛋白酶组合存在，并且可以以至多100%的产量生产VPP以及IPP。优 选地，氨肽水解活性也不含污染性的内切蛋白酶活性。本发明涉及含有水解产物或肽的组合物，所述组合物用作食物产品，或用作可以 被加入食物产品中从而在这样的食物产品中获得期望的ACE-抑制活性水平的浓缩物。或 者，根据本发明的含有水解产物或肽的组合物被用作营养药物，优选用作药物。本发明还涉 及本发明的含有水解产物或肽的组合物作为营养药物(优选药物)的用途，涉及本发明的 含有水解产物或肽的组合物用于制造营养药物(优选药物)的用途，涉及本发明的含有水 解产物或肽的组合物用于改善健康或预防和/或治疗疾病的用途，涉及本发明的含有水解 产物或肽的组合物用于制造营养药物(优选药物)的用途，涉及本发明的含水解产物或肽 的组合物用于治疗或预防心血管疾病如高血压和心力衰竭的用途，涉及本发明的含有水解 产物或肽的组合物用于治疗或预防肾衰竭的用途，涉及本发明的含有水解产物或肽的组合 物(其中本发明的含有水解产物或肽的组合物是膳食补充剂的形式)的用途，涉及本发明 的含有水解产物或肽的组合物用于制造用于治疗性治疗紧张效应的功能性食物产品的用 途，涉及本发明的含有水解产物或肽的组合物在局部应用(优选个人护理应用)中的用途， 和涉及本发明的含有水解产物或肽的组合物在饲料和宠物食物中的用途。另外，本发明涉及治疗1型和2型糖尿病的方法，和用于预防频繁伴随着2型糖尿 病的心血管并发症、患有前糖尿病的个体或葡糖耐量受损(IGT)的方法，所述方法包括对 需要这类治疗的受试者施用本发明的含水解产物或肽的组合物，还涉及治疗或预防遭受高 血压或心力衰竭的人的方法，所述方法包括对需要这类治疗的受试者施用本发明的含水解 产物或肽的并因此显示降血压效应的组合物。对ACE的抑制导致血管收缩减少，血管舒张 增加，钠和水排出提高，其反过来导致外周血管抵抗(periphral vascular resistance)降 低以及血压降低，以及局部血流改善。因此，本发明的包含肽的水解产物对于预防和治疗可 受ACE抑制影响的疾病特别有用，所述疾病包括但不限于，高血压、心力衰竭、心绞痛、动脉 梗塞、中风、外周动脉障碍疾病、动脉硬化、肾病、肾功能不全、勃起障碍、内皮功能障碍、左 心室肥大、糖尿病血管并发症、液体潴留(fluid retention)以及醛固酮增多症。通常认为，紧张相关疾病，以及紧张对身体的负面影响对于很多人有显著的作用。 近年来，在药物和科学界，紧张的影响，以及其对于多种疾病和病况发展的作用已获得了更 广泛的接受。消费者现在逐渐认识到这些潜在的问题，并开始对于减少或预防紧张对其健 康的可能的负面作用产生逐渐增加的兴趣。因此，本发明的另一方面是提供适合用于帮助身体应付紧张影响的食物产品，或可被包括进其中的成分。本发明的另一个目的是提供一 种食物产品，其包括提供健康益处(诸如帮助身体应付紧张的负面影响)的本发明的含水 解产物或肽的组合物。术语“营养药物”在本文中指在营养领域及制药领域应用中的有用性。因此，所述 新颖的营养药物组合物可作为食物和饮料的补充剂，也可作为药物制剂用于肠道或非肠道 应用，所述制剂可以是固体制剂，例如胶囊或片剂，或是液体制剂，例如溶液或悬浮液。从前 文明显可知，术语“营养药物组合物”还包含食物和饮料，其包含本发明的含水解产物或肽 的组合物以及可选地碳水化合物，以及包含前述活性成份的补充性组合物，例如膳食补充 剂。术语膳食补充剂在本文中指含有用以对膳食加以补充的“膳食成分”的、通过嘴摄 取的产品。这些产品中“膳食成分”可包括维生素、矿物质、草本物质或其它植物性药材 (botanical)、氨基酸和酶、器官组织、腺体(glandular)和代谢产物等物质。膳食补充剂可 以是提取物或浓缩物，其可以以多种形式出现，例如片剂、胶囊、软明胶(softgels)、明胶胶 囊(gelcaps)、液体或粉末。它们还可以是其它形式，例如条棒状，但是如果它们是的话，膳 食补充剂标签上的信息通常将不把产品标示为传统食品或餐食或膳食重的唯一项目。本发明中的营养药物组合物中还可以加入复合维生素及矿物质补充剂，以获得足 够数量的必需营养物，所述营养物在某些膳食中是缺乏的或已知相对较少。复合维生素及 矿物质补充剂还可用于疾病预防和防止营养缺乏及缺陷，所述营养缺乏及缺陷是由于生活 方式以及通常不充分的饮食模式造成的，这有时可见于糖尿病。此外，氧化应激也已被暗示 与胰岛素抗性的发展有牵连。活性氧物质(reactive oxygen species)可能通过扰乱胰岛 素受体信号级联过程来破坏由胰岛素激发的葡萄糖吸收。用抗氧化剂，例如α -生育酚(维 生素Ε)、抗坏血酸(维生素C)，来控制氧化应激对于治疗糖尿病来说可能是有价值的。因 此，复合维生素补充剂可添加到上述活性物质中，以保持良好的平衡营养。此外，本发明的含水解产物或肽的组合物与矿物质，例如镁(Mg2+)、钙(Ca2+)和/ 或钾(K+)的组合可用于改善健康以及预防和/或治疗疾病，包括但不限于心血管疾病和糖 尿病。 在本发明的一个优选方面，本发明的水解产物或营养药物组合物含有本发明的含 肽组合物。IPP和VPP适合以向将被施予的个体提供每kg体重大约0. OOlg至每kg体重大 约Ig的每日剂量的量存在于根据本发明的组合物中。食物或饮料适合分别含有每份大约 0. 05g至每份大约50g的IPP和VPP。如果营养药物组合物是药物制剂，此类制剂可以按每 个剂量单位，例如每个胶囊或片剂计，分别包含大约0. OOlg至大约Ig的量的IPP和VPP， 或者，对液体制剂而言，按每份每日剂量计，分别包含大约0. 035g至大约70g的量的IPP 和VPP。本发明的含水解产物或肽的组合物适合以向将被施予的个体提供每kg体重大约 0. Olg至每kg体重大约3g的每日剂量的量存在于根据本发明的组合物中。食物或饮料适 合含有每份大约0. Ig至每份大约IOOg的生物活性肽。如果营养药物组合物是药物制剂， 此类制剂可以按每个剂量单位，例如，每个胶囊或片剂计，包含大约0. Olg至大约5g的量的 含水解产物或肽的组合物，或者，对液体制剂而言，按每份每日剂量计，包含大约0. 7g至大 约210g的量的含肽组合物。在本发明的另一个优选方面，组合物包含前面指出的本发明的肽以及可选地，碳水化合物。碳水化合物适合以向将被施予的个体提供每kg体重大约0. Olg至每kg体重大 约7g的每日剂量的量存在于根据本发明的组合物中。食物或饮料适合含有每份大约0. 5g 至每份大约200g的碳水化合物。如果营养药物组合物是药物制剂，此类制剂可以按每个剂 量单位，例如，每个胶囊或片剂计，包含大约0. 05g至大约IOg的量的碳水化合物，或者，对 液体制剂而言，以每份每日剂量计，包含大约0. 7g至大约490g的量的碳水化合物。剂量范围(对70kg的人而言)VPP 和 IPP 0. 005-70g/ 天(每种)生物活性肽组合物0. 07-210g/天未水解蛋白质0. 07-210g/天碳水化合物0. l-490g/天本发明的一个目的是提供可用于向消耗其的个体提供健康益处的可食用物质。另 一个目的是提供可以以经分离形式或被包括进食物产品的、可被方便地摄取的此类可食用 物质。本发明的另一个目的是提供适合用于体重控制程序的食物产品，或可被包括进所 述产品的成分。本发明的另一个目的是提供适合用于帮助保持心血管健康(例如，通过ACE抑制) 的食物产品，或可被包括进所述产品的成分。本发明的另一个目的是提供具有可接受的稳定性和/或感官性质，特别是好的 味道，例如不存在不可接受水平的苦味的食物产品，或可被包括进所述产品的成分。本发明的另一个方面是提供一种食物产品，其具有高浓度的下述成分，所述成分 提供健康益处，例如协助预防肥胖/体重控制和/或帮助保持心血管健康。令人吃惊地，根据本发明，使用本发明的含水解产物或肽的组合物用于制备消耗 后提供健康益处的食物产品，实现了这些目的中的一个或多个。根据第一个方面，本发明提供了本发明的含水解产物或肽的组合物用于生产用于 预防肥胖或用于体重控制的功能性食物产品的用途。根据第二个方面，本发明提供了本发明的含水解产物或肽的组合物用于生产用于 心血管健康保持的功能性食物产品的用途。根据本发明尤其优选的是，心血管健康保持包括抑制血管紧张素转化(ACE)酶和 /或控制血液葡萄糖水平。根据第三个方面，本发明提供了能向其消耗者提供健康益处的功能性食物产品， 所述健康益处选自预防肥胖、体重控制以及心血管健康保持，并且，所述功能性食物产品 包含本发明的含水解产物或肽的组合物。根据本发明的含水解产物或肽的组合物的另一优点是，该含水解产物或肽的组合 物可被方便地包括食物产品，以生产出功能性食物产品，并且不会以不可接受的程度影响 到其稳定性和/或感官性质。根据本发明的“健康益处试剂”是当被摄取时提供健康益处的物质，S卩，对健康的 某些方面具有正面影响，或者帮助保持良好健康的某些方面的物质，良好健康的这些方面 是预防肥胖、体重控制和心血管健康保持。“健康益处”指对于健康的某些方面具有正面作 用，或者能帮助保持良好健康的某些方面。
根据本发明的“功能性食物产品”被定义为适合人类消耗的食物产品(为避免疑 惑，其包括饮料)，其中，本发明的含水解产物或肽的组合物以有效量用作为其成分，使得所 述食物产品的消费者获得显著的健康益处。术语“包含”在本文中使用时表示不限于任何随后指出的要素，而是表示包括具有 大的或小的功能重要性的未指出的要素。换句话说，列出的步骤、元素或选项不必是穷竭 的。当使用词语“包括”或“具有”时，这些术语与上面定义的“包含”等同。本发明方法的制品可以原样使用，或作为营养药物或营养制品的成分(任选地在 干燥后)使用。对本发明的另一方面而言，本发明方法的产物可以被进一步浓缩或纯化。可例如 将产物缓慢酸化，以将PH降低至4. 5或者至少低于5. 0。在该pH下，来自蛋白质底物如酪 蛋白酸盐的所有大的肽都沉淀，从而仅有较小的肽留在溶液中。优选地，将经酸化的混合物 在低温下保持数小时，以沉淀尽可能多的蛋白质和大肽。因为容易通过倾析或过滤步骤或 低速(即，低于5000rpm)离心去除沉淀的肽和蛋白质，所以水相含有相对于存在的蛋白的 量而言高比例的生物活性肽。按照Kjedahl数据，通过低速离心步骤除去了 80至70%的蛋 白质，这暗示对生物活性肽的四至五倍的纯化。可选地，通过随后的超滤步骤进一步增进纯 化。在营养药物应用以及食物和饮料应用中，有利地使用本发明的产物。生物活性肽、 其酸可溶性水解产物及其混合物可用于营养药物应用、食物应用或饮料。优选地，在营养药 物应用、食物应用或饮料中使用酸可溶性的生物活性肽，因为存在高含量的活性肽。在倾析、过滤或低速离心以除去发酵过程中形成的沉淀之后，可回收含有生物活 性肽的上清液。随后的蒸发，可选地，结合额外的过滤步骤，以及之后接着的喷雾干燥步骤 将产生用于获得具有高度生物活性以及良好的水溶解度的食品级糊状物或粉末的经济途 径。在额外的浓缩步骤之前或之后获得的生物活性肽可原样使用，或可用于加入食物 产品中，所述食物产品是基于常规被广泛消耗的。此类产品的例子是植物黄油、涂抹酱、多 种乳制品(例如黄油或酸奶或奶或含乳清饮料，优选地，基于酸奶或奶的产品，例如酸奶和 奶)。此外，在其它饮料，例如水果饮品或大豆饮品或甚至矿物质水或酒(Shots)中也可使 用本发明的生物活性肽。另一选择是在健康产品，例如水果条棒、蛋白质条棒、能量条棒，基 于谷物的产品(例如早餐谷类)中使用水解产物。优选地，食物或饮料产品或膳食补充剂 选自植物黄油、涂抹酱、黄油、乳制品或含乳清饮料的组，优选地，基于酸奶或奶的产品，例 如酸奶或奶，其中，所述食物或饮料产品或膳食补充剂包含上文指出的量的生物活性肽。特别优选的是用于减轻人类高血压的上文所述的食物或饮料产品或膳食补充剂。 食物或饮料或膳食补充剂的优选份大小为，例如，每份5-350克，例如，5至150克。优选地， 每天份数为1-10，例如2至5。虽然此类组合物典型地施予人类，它们也可施予动物，优选地，哺乳动物，以减轻 高血压。此外，获得的产品中高浓度的生物活性肽使得这些产品非常有用于被包括进丸剂、 片剂或高度浓缩的溶液或糊状物或粉末形式的膳食补充剂。将确保生物活性肽持续释放的 缓释膳食补充剂令人有着特别的兴趣。根据本发明的生物活性肽可作为干粉被配制进，例 如，丸剂、片剂、颗粒、小袋(sachet)或胶囊。或者，根据本发明的生物活性肽可作为液体被
16配制进例如糖浆或胶囊。用于多种制剂并且含有根据本发明的生物活性肽的组合物还可 包括生理上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稳定剂、缓冲剂以及稀释剂构成的组中的至少一 种化合物，这些术语按照它们普通的含义来使用，以表示协助包装、运送、吸收、稳定或者在 佐剂的情况下增加酶的生理作用的物质。可以与粉末形式的根据本发明的酶组合使用的 多种化合物的相关背景可在“Pharmaceutical Dosage Forms”，第二版，1、2和3卷，ISBN 0-8247-8044-2 Marcel Dekker，Inc中找到。虽然作为干粉配制的根据本发明的ACE抑制 肽可贮藏相当长的时间，但是应通过选择合适的包装，例如，铝泡罩(aluminium blister) 来避免与水分或潮湿空气的接触。相对新的口服应用形式是使用多种类型的明胶胶囊或基 于明胶的片剂。考虑到天然ACE抑制肽与对抗高血压的相关性，本发明的新的、成本效率高的途 径提供了针对温和降血压食品或者甚至兽用产品的有吸引力的起点。根据本发明的方法可用任何脯氨酸特异性寡肽酶或内切蛋白酶来完成。根据本发 明的或根据本发明使用的脯氨酸特异性寡蛋白酶表示属于EC 3. 4. 21. 26的酶。根据本发 明的或根据本发明使用的脯氨酸特异性内切蛋白酶表示WO 02/45524的权利要求1_5、11 和13中提到的多肽。优选地，所述多肽是经分离的形式。根据本发明的方法可以使用能够释放缬氨酸(“V”)残基以及谷氨酰胺(“Q”)和天 冬酰胺(“N”)残基的任何氨肽水解酶制剂。测量这类酶活性的检验明确于WO 2006/005757 的实施例12中。优选地，氨肽水解活性得自Aspergillus物种。Aspergillus属的菌株具有食品级状态，从这些微生物获得的酶已知能形成无可 质疑的食品级来源。根据另一种优选的实施方式中，酶由其生产细胞分泌，而并非是非分泌 的所谓胞质酶。以这种方式，可从细胞培养液中回收处于基本上纯的状态的酶，而无需昂贵 的纯化步骤。优选地，酶在通常的PH和温度条件下具有对其底物的高亲和性。


图1.在如实施例2中所述条件下发酵的脱脂奶中IPP浓度的提高。水平轴表示 发酵时间段后用脯氨酸-特异性内切蛋白酶温育的时间段，以小时为单位。指出的单位表 示PPU' s/g奶蛋白质。图2.在如实施例2中所述条件下发酵的脱脂奶中LPP浓度的提高。水平轴表示 发酵时间段后用脯氨酸-特异性内切蛋白酶温育的时间段，以小时为单位。指出的单位表 示PPU' s/g奶蛋白质。图3.在如实施例3中所述条件下从酪蛋白酸盐溶液中释放的IPP。水平轴表示用 脯氨酸_特异性内切蛋白酶温育的时间段，以小时为单位。垂直轴提供了以微克/毫升温 育液体为单位的IPP浓度。指出的单位表示PPU' s/g奶蛋白质。图4.在如实施例3中所述条件下从酪蛋白酸盐溶液中释放的LPP。水平轴表示用 脯氨酸_特异性内切蛋白酶温育的时间段，以小时为单位。垂直轴提供了以微克/毫升温 育液体为单位的LPP浓度。指出的单位表示PPU' s/g奶蛋白质。图5.如实施例3中所述条件下从GMP溶液中释放的IPP。水平轴表示用脯氨酸-特 异性内切蛋白酶温育的时间段，以小时为单位。垂直轴提供了以微克/毫升温育液体为单 位的IPP浓度。指出的单位表示PPU' s/g奶蛋白质。
材料和方法酪蛋白酸钾得自DMV International (荷兰)，糖巨肽(〃 Bio-PURE GMP “) 来自 Davisco Foods International, Inc. (US)。UHT 脱脂奶、Yakult 禾Π Vifit 产品 (后两者分别来自Yakult，荷兰和Campina，荷兰)得自本地超市。氨肽酶Corolase LAP Ch. :4123(〃 LAP")得自AB Enzymes (UK)，具有高氨肽酶活性的制剂P印tidase 436P(" P436P")得自 Biocatalysts Ltd，Wales，UK)。氨肽酶〃 ZBH"的过量生产描述于 WO 02/068623和WO 98/46772中。其色谱纯化通过Q_s印harose FF XK上进行的阴离子交 换色谱和之后在SP-S^harose XK上进行的阳离子色谱实现。来自Aspergillus niger的 脯氨酸特异性内切蛋白酶(〃 PSE")的过量生产及其色谱纯化如WO 02/45524中所述完 成。酶活性在PH 4. 6的柠檬酸/磷酸二钠缓冲液中，于37摄氏度，在合成肽Z-Gly-Pro-pNA 上检测。在405nm处通过分光光度方法监测反应产物。一个单位(PPU)被定义为在上述检 测条件下每分钟释放出Iymol对硝基苯胺(p-nitroanilide)的酶的量。一个PPU的来自 A. niger的脯氨酸-特异性内切蛋白酶对应于IOmg酶蛋白质。Kjeldahl 氮通过Flow Injection分析来测量总Kjeldahl氮。使用装备有TKN Method Cassette 5000-040, Pentinum 4 计算机(带 SOFIA 软件)和 Tecator 5027 Autosampler 的 Tecator FIASTAR 5000 Flow Injection System，在 590nm 处对从含蛋白质溶液中释放 出的氨进行定量。将对应于该方法动力学范围(0. 5-20mg Ν/1)的样品量与95-97%的硫酸 一起放置于消化管中，用Kjeltab对200摄氏度下30分钟，接着360摄氏度下90分钟的消 化程序进行处理。注射后，在FIASTAR 5000系统中测量氮峰，由其可推导出测量的蛋白的 量。氨基酸分析将精确称重的蛋白质材料样品溶解于稀的酸中，通过在Eppendorf离心机中离心 来除去沉淀。氨基酸分析在清澈的上清液上进行，这按照Amino Acid Analysis System of Waters (Mi lford MA, USA)的操作者手册指出的PicoTag方法来进行。为达到该目的，从 液体获得合适的样品，然后干燥，对其进行蒸汽相酸水解，使用异硫氰酸苯酯衍生化。使用 HPLC方法对存在的多种经衍生化氨基酸定量，加起来计算出称重样品中游离氨基酸的总水 平。氨基酸Cys和Trp不包括在该分析获得的数据内。LC/MS/MS 分析使用偶联到P4000 泵(Thermoquest ，Breda，the Netherlands)上的离子阱质 谱仪(Thermoquest , Breda，the Netherlands)的HPLC被用于对目标肽进行定量，包括 通过创造性的酶混合物生产的酶促蛋白水解产物中的三肽IPP、LPP和VPP。使用Inertsil 3 ODS 3，3mm，150*2. Imm 柱(Varian Belgium, Belgium)结合 Milli Q 水中的 0.1% 甲酸 (Millipore，Bedford，MA，USA ；溶液A)和乙腈中的0.1%甲酸(溶液B)梯度用于洗脱，来 分离形成的肽。梯度起始自100%的溶液A，保持5分钟，10分钟内线性增加至5%溶液B， 接着在30分钟内线性增加至45%溶液B，紧接着回到起始条件，保持15分钟以稳定。所使 用的注射体积为50微升，流率为每分钟200微升，柱温保持为55°C。注射样品的蛋白浓度 为大约50微克/毫升。关于各种肽的详细信息通过使用针对目标肽的专门MS/MS来获得，其中使用大约30%的最优碰撞能。对各种肽的定量使用外部校正来进行，其中使用MS/MS模式中观察到 的最丰富的片段离子来进行。三肽LPP (M = 325. 2)被用于在MS模式中针对最优敏感度进行微调，在MS/MS模 式中针对最优片段化进行微调，其具有5mg/ml的恒定注入率，导致在MS模式中产生质子化 分子，在MS/MS模式中产生大约30%的最优碰撞能，产生B-和Y-离子系列。在LC/MS/MS之前，在环境温度和13000rpm下对酶促蛋白水解产物或生物活性肽 组合物进行10分钟离心，经过0.22μπι过滤器进行过滤，用MilliQ水对上清液进行1 100 的稀释。水解程度使用快速 OPA 测试(Nielsen, P. Μ. ；Petersen, D. ；Dambmann, C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis. Journal of Food Science 2001, 66,642-646)，对与多种蛋白水解混合物进行温育期间获得的水解程度(DH)进行监测。水 解程度是肽键被酶促水解反应破坏的程度的度量。
实施例实施例1诵i寸用_氡,酸-特异件温育脱J旨奶(仵诜地,与Lactobacillus发酵鉬合) 来释放降血压的三肽为了测试来自Aspergillus niger的脯氨酸-特异性内切蛋白酶对已知的降血压 肽IPP、VPP和LPP释放的影响，在六种不同的条件下温育脱脂奶。在第一组三个实验中， 用脯氨酸-特异性内切蛋白酶或脯氨酸-特异性内切蛋白酶和纯氨肽酶的组合对原样的 脱脂奶进行温育。在第二组三个实验中，首先在37°C下用高度蛋白水解的Lactobacillus helveticus菌株(LKB-16H)温育脱脂奶，然后将pH被降低至约为5. 7时，添加脯氨酸-特 异性内切蛋白酶或脯氨酸-特异性内切蛋白酶与纯氨肽酶的组合，并将温育再摇动继续 24小时。在所有这些实验中使用相对高的酶浓度来预防过低的酶剂量导致酶添加无影响 的结论。酶反应终止后，将凝固的反应混合物离心并过滤上清液，之后通过LC/MS(参阅 材料和方法)对三肽定量。添加氨肽酶的有益影响解释于W02006/005757中。简言之， 牛奶酪蛋白包括数种不同蛋白，包括beta酪蛋白和kappa酪蛋白。根据已知的氨基酸 序列，beta酪蛋白包含ACE抑制三肽IPP、VPP和LPP。在beta酪蛋白中，IPP被含有于 序列-P71-O72-N73-I74-P75-P76-中，VPP 被含有于序列-P81-V82-V83-V84-P85-P86-中，LPP 被含 有于序列-P15tl-L151-P152-P153-中。κ酪蛋白以几乎为beta酪蛋白浓度的50%的摩尔浓 度存在于酸沉淀的酪蛋白酸盐制剂中，其仅包含IPP。kappa酪蛋白中，IPP被含有于序 列-Aiot-I1C18-P1C19-P11CT中。因为脯氨酸_特异性内切蛋白酶能够在脯氨酸和丙氨酸的C-端 切割肽键(但是在P-P序列内则不)，所以用脯氨酸_特异性内切蛋白酶温育脱脂奶从 κ-酪蛋白中释放IPP以及从β-酪蛋白中释放LPP。另外，分别整合IPP和VPP的五肽 QNIPP和VVVPP从β -酪蛋白生产。为了从这些五肽中释放IPP和VPP，需要氨肽酶活性。 理论上氨肽酶活性可以通过裂解发酵过程中生产的Iactobacilli来提供。然而，这类氨肽 酶活性可能过低，使得根据本发明可以作为外部酶提供活性。在本发明的实验中，以商品 Corolase LAP的形式提供所述氨肽酶活性。
如在表1中可以看到的，在无Lactobacillus helveticus的温育中，脯氨 酸-特异性内切蛋白酶和氨肽酶的组合导致最高水平的三种降血压三肽。此外，在存在 Lactobacillus helveticus菌株时，与添加的额外的内切蛋白酶和氨肽酶组合时IPP、LPP 和VPP水平最高。补充了额外的脯氨酸-特异性内切蛋白酶和氨肽酶的Lactobacillus helveticus菌株的存在导致最高水平的三种降血压三肽的事实显示，高度蛋白水解的 Lactobacillus helveticus菌株单独提供的蛋白水解酶活性不足以在奶发酵期间最大化 降血压三肽的产量。表1 以mg/g奶蛋白质为单位的降血压三肽的浓度
肽不添加酶添加PSE添加PSE+氨肽酶脱脂奶IPP0.00.110.18VPP0.00.050.56LPP0.00.090.10脱脂奶 + IactobacilliIPP0.010.100.29VPP0.040.051.13LPP0.00.190.26PSE =来自A. niger的脯氨酸-特异性内切蛋白酶，其以4PPU/g蛋白质的浓度存 在氨肽酶=CorolaseLAP Ch. :4123(AB Enzymes, UK)，其以 125 微升/g 蛋白质的 浓度存在实施例2完成lactobacillus发酵后添加脯氨酸-特异件内切蛋白酶的影响如实施例1中所示，在用高度蛋白水解的Lactobacillus helveticus菌株发酵期 间变得可用的蛋白水解活性事实上不足以从奶中高效释放降血压三肽。还如实施例1中所 示，脯氨酸-特异性内切蛋白酶(或优选脯氨酸-特异性内切蛋白酶加合适的氨肽酶)的 添加能够对此进行补偿。所述脯氨酸-特异性内切蛋白酶(或优选脯氨酸-特异性内切蛋 白酶加合适的氨肽酶)可以在发酵过程之前、期间或之后添加，从而增强降血压三肽的产 量，和获得可再现的终产物(见实施例4和5)。本实施例阐述了在完成发酵过程后添加脯 氨酸-特异性内切蛋白酶的影响。在37°C的脱脂奶发酵结束后，首先热处理得到的经酸化的奶制品从而杀死存在的 Iactobacilli，之后通过添加KOH使悬浮液的pH提高至4. 7或5. 9。并入pH 5. 9调节来测 试随后的酶温育期间更高的PH条件是否会有助于许多酪蛋白凝块的溶解，所述酪蛋白凝 块由于发酵期间奶的酸化而形成。pH调节后，以0. 5或3. OPPU/g奶蛋白质的浓度添加来自 A. niger的脯氨酸-特异性内切蛋白酶，并在50°C下将温育继续2、4、6或23小时。在每个 温育时间段结束时，通过在95°C下10分钟的热处理使内切蛋白酶失活，并通过离心去除不 溶材料。根据材料和方法章节中描述的LC/MS程序，测量澄清的上清液中降血压三肽IPP 和LPP的浓度。根据结果(见图1和2)可以得出结论，作为酶温育的结果，特别是LPP的产量(图2)显著提高。用最高的PH值温育导致最高LPP产量的事实提出，事实上酪蛋白 凝块的溶解而不是提高的酶活性在起作用，因为脯氨酸-特异性酶在这类相对高的PH值下 活性较低。对IPP生产(图1)而言得到了类似但是较不极端的观察结果。获得的数据还 证明，尽管高酶剂量(3PPU/g奶蛋白质)导致更高的LPP和IPP产量，但是用几乎十倍更低 的酶剂量(0. 5PPU/g奶蛋白质)获得的差异是微小的，因为使用低酶剂量可能更加成本有 效。实施例3从酪蛋白酸盐和糖巨肽中释放最大水平的降血压肽需要的酶剂量详述于本申请中的本发明的一个优点是可以从不同的含奶蛋白质的产物开始并 使用不同的发酵菌株制造多种产物，从存在的所述奶蛋白质得到最大量的降血压肽。为了 获得关于肽产量的最佳结果，必须针对使用的底物类型和发酵方法优化酶剂量。然而，一旦 被优化则获得高度可再现的生产方法，其中低水平的外源酶满足生产最高量降血压肽的要 求。从脱脂奶中生产最大量IPP、VPP和LPP水平所需的酶剂量列于实施例1和实施例2中。 本实施例显示从酪蛋白酸钾以及糖巨肽中释放相关的降血压肽，并例证了优化肽产量所需 的酶/奶蛋白质比例。实施例1中提到了理论上存在于每种这些底物中的降血压肽。糖巨 肽(GMP)是在用凝乳酶切割后从κ-酪蛋白中释放并且并入单个IPP序列(Iltl8-P1Cl9-P11Cl) 的可溶片段。为了专注于添加的酶的影响，在该实验中不用微生物接种酪蛋白酸盐和GMP 溶液，从而不发生发酵。将酪蛋白酸钾(DMV，荷兰)溶于水中，获得加入约8% (w/w)蛋白质并具有约6. 6 的PH的液体。然后将pH降低至5. 9，将液体分布于大量摇瓶中，以每克存在的奶蛋白质5、 7. 5和IOmg酶蛋白质的浓度添加纯脯氨酸-特异性内切蛋白酶。温育于55°C下摇动进行 多达24小时的时间段。以规则的间隔采样并在90°C下加热30分钟，以终止所有微生物和 酶活性。然后将这些经加热的样品在Eppendorf离心管中于6000rpm离心10分钟，之后通 过〃 Vivaspin"离心浓缩器(Vivascience，Sartorius Biolab Products，德国)进一步纯 化，并在摇动式转子(swing-out rotor)中于3200g下离心30分钟。通过LC/MS直接分析 得到的渗透物，以定量存在于每种样品中的IPP、VPP和LPP的水平。得自IPP的结果展示 于图3中，得自LPP的结果展示于图4中。在GMP的情况下遵循类似的途径。将GMP溶于水中达到7 % (w/w)的浓度，之后将 PH调节至5. 9。以每克存在的奶蛋白质5、7. 5和IOmg酶蛋白质的浓度用纯脯氨酸-特异 性内切蛋白酶温育，温育于55°C下摇动进行多达8小时的时间段。如所述针对酪蛋白酸盐 采样并分析IPP和LPP浓度，得到图5中所示结果。基于获得的结果可以得出结论，相对存 在的每克(奶)蛋白质而言约IOmg脯氨酸-特异性蛋白酶的剂量足以释放存在的所有降 血压肽。实施例4在存在多种 时通丄寸多种微勿发酵的脱J旨奶、SSg白Il钾禾Π_巨肽溶液Φ的降 血压肽如实施例1和2中所示，即便是使用所选择的高度蛋白水解的lactobacillus物 种也不能保证在发酵期间释放所有降血压肽。这意味着在含奶蛋白质的底物上培养时，则 具有更低的蛋白水解能力的许多微生物会完全不能产生降血压肽。然而，用这类微生物发酵奶蛋白质在其它方面可能是期望的，例如因为这些微生物适合用作益生菌，或者它们在 质感或口味方面改善产物。根据本发明的酶促途径，从奶蛋白质释放降血压肽不再依赖于 使用的发酵菌株的性质。因此，根据本发明的酶途径允许在单个产物中组合若干益处，即与 降血压活性组合的改善的口味、质感、益生菌活性。在本实施例中，我们会例证根据本发明的方法释放降血压肽是高度可再现的， 在涉及不同的含奶蛋白质的底物时也是如此。另外，我们例证了降血压肽可以在所有这 些情况下和与大量多种工业上使用的微生物组合产生。这一实验中使用的乳酸细菌或 Bifidobacteria的身份和特征详述于表2中。表2:测试的微生物 代码100H、CY-221、MY-721 和 UX-21 B 表示可从 DSM-Food Specialities (Delft, 荷兰)商业获得的初始培养物。“Yakult”和“Vifit”是指从以这些名字出售的商品中获得 的接种物。将使用的菌株在25ml UHT脱脂奶中于37°C下预孵育22小时的时间段，向其中添加0. 酵母提取物。用菌株UX-21B接种的液体总是在30°C下温育。通过接种0. 5ml可 商业获得的产物获得“Yakult”和“Vifit”菌株。就实际的测试而言，制备加入不同奶蛋白质组分的三种不同的生长培养基UHT 脱脂奶、去矿物质化水中35g/l酪蛋白酸钾溶液和去矿物质化水中35g/l GMP溶液。通过 添加额外的0.1% (w/w)酵母提取物富集所有三种液体。向酪蛋白酸盐和GMP溶液中还添 加 0. (w/w)乳糖。通过在90°C下预加热15分钟然后在85°C下30分钟，在水浴中对酪蛋白酸盐和 GMP溶液巴氏消毒。然后将UHT奶、酪蛋白酸盐和GMP培养基各自分成三份不添加酶、添加 脯氨酸-特异性内切蛋白酶(15mg酶蛋白质/g奶蛋白质)和添加脯氨酸-特异性内切蛋 白酶加氨肽酶(Corolase LAP) (125微升/g奶蛋白质)。将由此获得的九种蛋白质/酶培 养基样品均个别地用表2中所列六种菌株中的每一种的0. 5ml预培养物接种(每50ml生 长培养基0. 5ml预培养物)。九种培养基中每一种的一个样品不接种而是用作参照。将培 养基在37°C下站立温育24小时；用菌株UX-21 B接种的培养基在30°C下温育。温育结束时，从每个温育管中采取小样，并在90°C下加热30分钟，以终止所有微 生物和酶活性。然后如实施例3中所述处理这些经加热的样品，并通过LC/MS分析来定量 每个样品中存在的三肽IPP、VPP和LPP的水平。获得的结果展示于表3 (UHT奶)、表4 (酪 蛋白酸钾)和表5(GMP)中。在后面三个表中展示的结果的基础上可以得出结论，根据本发 明的酶和发酵技术的组合提供了制备奶蛋白质的一种有效方式，所述奶蛋白质以加入高水 平降血压肽的消费者产品为基础。表3 原样温育后，用多种微生物接种后，添加脯氨酸-特异性内切蛋白酶(PSE) 后，添加氨肽酶(LAP)后或添加微生物和酶的组合后，UHT脱脂奶中以微克/ml为单位的降 血压三肽的浓度。温育混合物中省略菌株或酶用“_”表示。 表4:原样温育后，用多种微生物接种后，添加脯氨酸-特异性内切蛋白酶(PSE) 后，添加氨肽酶(LAP)后或添加微生物和酶的组合后，酪蛋白酸钾溶液中以微克/ml为单位 的降血压三肽的浓度。温育混合物中省略菌株或酶用“_”表示。
表5 原样温育后，用多种微生物接种后，添加脯氨酸-特异性内切蛋白酶(PSE) 后，添加氨肽酶(LAP)后或添加微生物和酶的组合后，GMP溶液中以微克/ml为单位的降血 压三肽的浓度。温育混合物中省略菌株或酶用“_”表示。不可检出的LPP和VPP水平用nd表不。 实施例5经发酵的脱脂奶水解产物中的降血压肽根据本发明的酶途径，从奶蛋白质释放降血压肽不再依赖于使用的发酵菌株的性 质。因此，根据本发明的酶途径允许在单个产物中组合若干益处，即与降血压活性组合的改 善的口味、质感、益生菌活性(如由所选择的发酵菌株带来)。酶促途径使得整个过程多用 得多，因为酶保证降血压肽的高产量，使得发酵步骤变得灵活，即发酵过程可以在酶温育之 前、期间或之后进行。在发酵过程前用酶温育含奶蛋白质的底物是特别感兴趣的，因为这允 许使酶失活，从而加入降血压肽的最终产物可含有有活力的微生物。后一特征对益生菌产 物以及特殊的酸奶而言可以是重要的。在本实施例中我们描述了在脱脂奶的酶处理后进行的发酵过程。另外，例证了多 种类型的氨肽酶对降血压肽产量的影响。从可商业获得的UHT脱脂奶中采取IOml样品作
26为参照材料。向剩余的990ml脱脂奶中，首先添加35PPU的脯氨酸-特异性蛋白酶，并快速 混合。从该材料中获得11部份，每部分10ml。根据表6中所说明的列表，向这些部分中的 10个中添加氨肽酶制剂。剩余的部分作为参照，并且不添加氨肽酶。所有这些样品的温育 在55°C下摇动进行4小时，之后通过95°C下10分钟的热处理使存在的酶失活。然后将每 部分的Iml样品离心，如实施例3中所述处理上清液并通过LC/MS分析来定量每个样品中 存在的IPP、VPP和LPP水平。获得的结果展示于表6中，并且显示在用单独的脯氨酸_特 异性内切蛋白酶(第2管)预温育后，可以获得显著的降血压肽水平。然而，添加氨肽酶活 性(第3到13管)将这些水平增强至释放约90%第13管中理论存在的所有IPP。将剩余的9ml部分(第1到13管)冷却，通过离心去除任何蛋白质沉淀物，并用 传统的酸奶培养物CY_340(可得自DSM-Food Specialities, Delft，荷兰)接种剩余的所 有上清液。在37°C下温育10小时后，在粘度、口味和细胞生长方面评价多种终产物。除了 含有未经蛋白酶处理的UHT奶的管(第1管)之外，多种温育物的粘度均因为发酵而微小 地提高，这使得它们适合作为例如饮品酸奶。所有接种的产物均显示可观的微生物生长，典 型的在109CfU/ml左右。另外，所有产物具有轻微的、酸奶样的口味。只有用P436P酶产物 预处理的产物有苦味，推测是因为所述酶产物除了其氨肽酶活性以外还包括显著量的内切 蛋白水解活性。表6 :UHT脱脂奶中以微克/ml为单位的降血压三肽的浓度。
*使用的氨肽酶在材料和方法章节中说明。为了保证相当的氨肽水解活性，制备 在活性检验的基础上被标准化的每种氨肽酶制剂的溶液，所述活性检验使用Leu-pNA作为 底物。为此在PH 6. 5和37°C下用多种制剂温育Leu-pNA的饱和溶液。使用Tecan-Genios MTP Reader (Salzburg，Vienna)在405nm处10分钟的动态测量中动态监测每种制剂对pNA 的释放。根据获得的数据，ZBH浓缩物(14mg蛋白质/ml)显示与五倍稀释的(2mg蛋白质/ ml) Corolase LAP (批次8044)制剂和200mg/ml P436P粉末溶液可比较的氨肽酶活性。表 6中说明的氨肽酶活性量是指从后三种酶溶液获得的体积。
28
权利要求
生产包含三肽IPP和/或三肽VPP的经发酵的奶制品的方法，所述方法包括使用奶蛋白质作为起始材料，其中使用合适的乳酸细菌或Bifidobacterium对所述奶蛋白质进行发酵步骤，并使用脯氨酸 特异性内切蛋白酶或脯氨酸特异性寡肽酶进行酶温育步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中使用得自Aspergillus，优选地得自Aspergillus niger的脯氨酸-特异性内切蛋白酶。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述脯氨酸-特异性内切蛋白酶或脯氨酸特异性 寡肽酶以基于奶蛋白质0. 05衬％到1. 7wt%的量添加。
4.根据权利要求1到3中任一项的方法，其中在所述酶温育步骤中还使用氨肽酶。
5.根据权利要求4的方法，其中所述氨肽酶得自Aspergillus。
6.根据权利要求4或5的方法，其中所述氨肽酶以基于奶蛋白质少于的量添加。
7.根据权利要求1到6中任一项的方法，其中还生产LPP。
8.根据权利要求1到7中任一项的方法，其中所述经发酵的奶制品具有5%到38%，优 选10%到38%，更优选15%到35%的水解度(DH)。
9.根据权利要求1到8中任一项的方法，其中在所述发酵步骤中所述乳酸细菌或 Bifidobacterium 是 Lactobacillus，例如 Lactobacillus helveticus、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus bulgaricus 或 Lactobacillus, delbrueckii ssp.Bulgaricus, Lactococcus， 例 如 Lactococcus Iactis, Leuconostoe, Pediococcus 或 Streptocoocus,或是 Bifidobacteria 的代表如 Bifidobacterium animalis、Bifidobacterium brevis、Bifidobacterium infantis 禾口 Bifidobacterium longum。
10.根据权利要求1到9中任一项的方法，其中所述酶步骤在所述发酵步骤之前。
11.根据权利要求1到9中任一项的方法，其中所述酶步骤在所述发酵步骤期间发生。
12.根据权利要求1到9中任一项的方法，其中所述酶步骤在所述发酵步骤后发生。
13.生产食物、饲料、宠物食物、营养药物或营养成分或要用于食物、饲料、宠物食物或 营养药物中的成分的方法，所述方法包括在所述食物、饲料、宠物食物、营养药物或营养成 分或其成分中加入包含三肽IPP和/或三肽VPP的经发酵的奶制品，所述经发酵的奶制品 用权利要求1到12中任一项的方法生产。
14.能够通过权利要求13的方法获得的食物、饲料、宠物食物、营养药物或营养成分或 要用于食物、饲料、宠物食物或营养药物中的成分。
15.通过权利要求1到12中任一项的方法生产的包含三肽IPP和/或VPP的经发酵的 奶制品用于制备食物、饲料、宠物食物、营养药物或营养成分或要用于食物、饲料、宠物食物 或营养药物中的成分的用途。
全文摘要
本发明涉及生产三肽IPP和/或三肽VPP的方法，所述方法包括使用蛋白质作为初始材料，其中使用合适的乳酸细菌或Bifidobacterium对所述蛋白质进行发酵步骤，并且使用脯氨酸特异性内切蛋白酶或脯氨酸特异性寡肽酶对所述蛋白质进行酶温育步骤。
文档编号A23L1/305GK101925674SQ200880125429
公开日2010年12月22日 申请日期2008年11月19日 优先权日2007年11月23日
发明者卢卡斯·希瑞尔·杰勒德·海丹·范德, 路泊·埃登斯 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司