专利名称：由茶树叶生产微体幼芽的一步法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种由茶树叶生产微体幼芽的新一步法。
茶是一种受欢迎的具有抗癌特性的含咖啡因饮料(Jankun等，为什么饮茶可以预防癌症，《自然》(Nature)5561；1997)。虽然山茶属有许多种，但仅C.sinensis(L.)O.Kuntze或茶及其诸如Chinary、Assamica和Cambod的不同栽培品种在商业上是很重要的(Braua D.N.“茶树贸易”于Barua D.N.编辑，《茶叶栽培中的科学和实践》中，加尔各答茶研究协会；53-68；1989)。
茶叶栽培不仅是重要的职业提供源、而且也是世界所有茶叶生长地区挣取外汇的主要途径(Wilson，K.C.编辑的《咖啡、可可和茶》中的“植物学和植物改良”，CABI出版，Wallingford，UK167-173；1999)。但是，茶叶的总产量不足以满足本国和世界市场的需要(Kabra，G.D.，1999年茶叶统计资料，《茶时代》(Tea time)Vol VIII，No.3 9-11，99，30-31；1999)。由于不同的生命性的(真菌、害虫和病毒)和非生命的(冰冻、冰雹、寒冷、干旱、营养不良等)应力使茶叶的产率和质量进一步降低(Wilson，K.C.编辑的《咖啡、可可和茶》中的“植物学和植物改良”，CABI出版，Wallingford，UK167-173；1999)。
实际属于木本树种的茶树具有较长的生活周期以及高度自身不相容性和近亲繁殖萧条(Barua D.N.编辑，《茶叶栽培中的科学和实践》中的Barua D.N.“茶树贸易”，加尔各答茶研究协会；53-68；1989)，这通常限制了通过常规的育种方法生产高产率且优等和抗应力茶树。因此，生物技术方法的应用是一种有效且可供选择的方法。但是，预先必备一种有效率且能繁殖的再生方法对于生物技术应用是最重要的。
茶叶中的最严重问题是水疱枯萎病，因为它侵害用于制茶的叶子和幼芽，结果产率下降了50％。因此，抑制水疱枯萎病对于弥补这些损失是非常急需的。已确定了一些具有高产率和高质量但易患水疱枯萎病的克隆，因此需要通过诸如叶外植体的同源组织的生物技术改良，因为诸如子叶外植体的异质组织会导致基因分离和所需的高产率和高质量的特性的丧失。因此，现存的方法在于诸如子叶外植体的异质组织不具有上述有关用途并且还需要保持优良植物特性类型的准确。因此，急需发展采用同源组织的微体繁殖的方法。叶外植体的再生是最佳的优选，因为(i)叶外植体是同源的；(ii)叶外植体的再生总是产生忠实于原始的选择性优良特性类型的植物；(iii)叶子含有极大量复制数的叶绿体DNA，因此在进行任何基因操作时如转基因或体细胞杂交的研制中使用叶子，则叶子表达可以扩增数倍；(iv)叶子为任何基因操作技术提供了大量表面；(v)叶子是市售的成品茶的主要商业来源；(vi)叶子提供了丰富的原料供应；(vii)采用叶子作为外植体不会防碍一般的好的特性和植物的生长；倘若在再生过程中没有出现体细胞克隆变异，那么通过体细胞杂交或通过转基因技术的生物技术作物改良通常需要经愈伤组织相的再生。由于茶树寿命长，与快速生长的草本植物相比，愈伤组织相中的染色体变异的可能性要低。因此，本申请报道了使用经愈伤组织相的微体繁殖茶树的有效一步法。如果使用叶外植体或如果植物为50年或更长的非常老的树，木本植物的再生能力很差。
为了产生经体细胞胚胎发生的植物或经愈伤组织相的未定形幼芽形成，但要么转化频率低(4-6％)或要么生根很少，已将叶外植体用于山茶属的其它观赏植物种中，即C.japonica和C.reticulata(Sanjose，M.C.和Vieitez，A.M.成熟Camellia reticulata的体外叶子的未定形幼芽再生，《园艺科学杂志》(J.Hort.Sci.)67677-683；1992；Sanjose，M.C.和Vieitez，A.M.“通过胚胎发生和柄茎发生来源于叶外植体培养物的山茶属小植株的再生”，《园艺科学》(Sci.Horti.)，54303-315；1993；Pedroso，M.C.和Pais，M.S.的C.japonica L.叶中的直接胚胎形成”，《植物细胞再配(Rep.)》12639-643；1993)。而且，这些均是观赏植物种。但是，没有有关通过茶即商用的山茶属或茶树中的愈伤组织、用于未定形幼芽形成的叶外植体的植物再生的方法的报道。至今也没有从茶或任何其它观赏植物种中的叶外植体再生幼芽的一步法的报道。
为了研究叶外植体的再生方法，Nakamura Y.在1984年做了首次尝试(茶树体外繁殖的有效方法，Proc.Internat.Symp.有关茶叶产量的最近发展，中国，台湾，198463-74页)，其中愈伤组织是在补充有茁长素2，4-二氯苯氧乙酸的Nitsch和Nitsch培养基(Nitsch，J.P.和Nitsch C.，来源于花粉粒的单倍体植物，《科学》(Sci.)(Washington)，16385-87；1969)和Gamborg培养基(Gamborg，O.L.，Miller，R.A.和Ojima，K.大豆根细胞的悬浮液培养物的营养需要，《实验细胞研究》50151-58；1968)中获得的。该方法的缺点是尽管在形态发生的不同步骤中使用了不同的培养基，但未能获得形态发生或未定形幼芽形成。
在1985年，Nakamura(Nakamura，Y.外植体的起源对茶树组织培养中的根的分化和其不同品种的影响，Shizuoka茶实验站621-8；1985)和Palni、Sood、Chand、Sharma、Rao和Jain(Palni，L.M.S.Sood，A.，Chand，G.，Sharma，M.，Rao，D.V.，Jain，N.K.茶中的组织培养研究，Proc.International Sym.有关茶叶科学，Shizuoka，日本，395-399，1991)又尝试了经愈伤组织相的叶外植体的植物再生，其中从叶愈伤组织中获得了生根或根形成，但是缺点是这种生根愈伤组织没有产生根并且使用了两种不同的培养基。此后，直至1996年才有有关叶外植体的植物再生的报道，其中Kato(Kato，M.体外生长的茶幼芽的未成熟叶的体细胞胚胎发生，《植物细胞再配(Rep.)》15920-926；1996)从来源于Murashige和Skoog培养基(Murashige T.和Skoog F.A用于烟草组织培养的快速生长和生物测定的改进培养基，《植物生理学》(Physiol.Plant)15473-497；1962)中的体外生长植物的叶外植体的体细胞胚胎得到了一些植物，该培养基补充在液体中的0.5mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸和0.8％琼脂固化培养基中的5mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸。
Kato的方法的主要缺点列举如下(i)有关体细胞胚胎诱导的外植体应答的百分比非常低(6％)；(ii)供体植物是导致子代中的基因变异的树苗；(iii)体细胞胚胎转化为植物的频率非常低，即7.1％；(iv)将被诱导的胚胎控制在叶的特定区域内、而不从所有叶表面为它们提供不适合的转基因研究；(v)不包括用于从具有优良特性的成熟的选择性矮树丛中培养叶外植体的系统，而包括从树苗的叶外植体中的胚胎发生愈伤组织的开发；(vi)树苗代表异质群体，而从选择性成熟树收集的外植体具有优良特性，因为它们通过克隆或无性繁殖方式进行繁殖；(vii)将不同的培养基用于诸如胚胎诱导、第二次胚胎发生和胚胎萌发的不同步骤过程。
本发明的主要目的是在单一步骤中从茶树的叶外植体开发健壮的幼芽；
本发明的另一个目的是将有关的外源基因引入叶外植体并通过直接biolistic枪或间接植物肥大病菌属来开发大量基因修饰植物；本发明还有一个目的是开发一种有效的微体繁殖方法，该方法是使用单一植物生长激素的合算的单一步骤法；本发明还有一个目的是通过在塑料陪替氏培养皿(可经高压灭菌的)中使用仅25ml的培养基和通过避免传代培养、开发一种从叶外植体微体繁殖茶的合算且劳动效率高的有效方法；本发明还有一个目的是在一旦杂交体愈伤组织形成的情况下、不需进一步传代培养而开发一种用于来源于原生质体的叶的微体繁殖和体细胞杂交的有效方法；本发明还有另一个目的是将有关基因引入原生质体并研究其表达；本发明的另一个目的是在病毒的诊断程序中促进病毒颗粒的吸收。
因此，本发明提供了在单一步骤中从茶树的叶外植体开发健壮幼芽的新方法。
因此，本发明提供了一种从叶外植体微体繁殖茶的新的、高效率的、简单的、合算且劳动效率高的方法，其中幼芽可从市售的山茶属或茶树的任何栽培品种(即Chinary、Cambod或Assamica)的叶发育而成。将幼芽尖端的第二和第三叶置于9.0cm塑料陪替氏培养皿(可高压灭菌的)中的含2，4-二氯苯氧乙酸(5.0-10.0mg/l)但优选5.0mg/l的2，4-D的25ml标准基本Murashige和Skoog培养基中，没有任何类型的新鲜培养基中的传代培养。在至少2-4周后但优选2周后于所有叶外植体的表面观察到愈伤组织。在至少4-6周后但优选4周后于同样的陪替氏培养皿中的同样培养基中观察到生根或根形成。最终，4-6周后但优选4周后在同样的陪替氏培养皿中的同样培养基中也观察到幼芽形成。本方法的新颖性在于(a)不需要任何后续步骤；(b)仅需要一种植物生长调节剂2，4-二氯苯氧乙酸(5.0-10.0mg/l)；(c)不需传代培养；(d)整个方法仅在该方法开始时需要25ml培养基；(e)在同一培养基(当其渐渐减少时)中可观察到形态发生(生根和幼芽形成)的所有步骤，因此使得该方法合算且劳动效率高。
因此，本发明提供了从茶叶外植体生产微体幼芽的新一步法，该方法仅包含约10-16周的单一步骤，其中(a)将任何栽培品种(即Chinary、Assamica和Cambod)的体外培养植物的叶外植体置于9.0cm可高压灭菌的塑料陪替氏培养皿中的补充有维生素如维生素B1-HCl(0.05-2.0mg/l)、维生素B6-HCl(0.25-1.5mg/ml)和烟酸(0.25-1.5mg/l)与甘氨酸(1.0-3.0mg/l)、2，4-二氯苯氧乙酸(5.0-10mg/l)的25ml琼脂固化的(0.8-1.0％)标准基本Murashige和Skoog培养基(Murashige T.和SkoogF.A用于烟草组织培养的快速生长和生物测定的改进培养基，《植物生理学》(Physiol.Plant)15473-497；1962)中；(b)2-4周后但优选2周后在同样的培养基中观察到愈伤组织发育；(c)4-6周后在同样但部分减少的培养基中的叶愈伤组织上观察到生根或根形成；(d)最终，4-6周后在同样但几乎干燥且减少了的培养基中的生根愈伤组织上也观察到幼芽形成；(e)将如此形成的幼芽转移至含液体培养基的繁殖培养基中以进行繁殖，该培养基补充有5μm苯基噻二唑基脲(Sandal I.，BhattacharyaA.和Ahuja P.S.2001.用于茶树幼芽繁殖的高效液体培养系统，植物细胞组织器官培养00.1-6)；(f)用吲哚-3-丁酸处理至少3.0cm长幼芽的切除末端20-30分钟、并转移至覆盖有广口瓶的无菌沙土混合物(1∶1)中至少60-75天，然后转移至开放的塑料罐(Sandal I.，BhattacharyaA.和Ahuja P.S.2001。用于茶树幼芽繁殖的高效液体培养系统，植物细胞组织器官培养00.1-6)中。
在一个实施方式中，将选择性植物的三个栽培品种(Chinary、Assamica和Cambod)的新鲜的完全折叠的、半开放的或全张开的叶作为外植体。将此叶子在含多菌灵(0.1％)和链霉素(0.05％)的溶液中清洗、在吐温20中洗涤和在含一滴液体清洁剂的0.01％(w/v)氯化汞溶液中表面灭菌、然后在无菌蒸馏水中彻底洗涤。然后将表面灭菌后的外植体按上述方法培养。
在本发明的另一个实施方式中，如上所述使用杂交栽培品种Chinary、Assamica和Cambod的体外或间接体外培养的选择性植物的叶外植体i)将任何栽培品种的杂交体的体外培养的完全折叠的、半开放的或全张开的叶外植体置于9.0cm可高压灭菌的塑料陪替氏培养皿中的标准的基本Murashige和Skoog培养基(Murashige T.和Skoog F.A用于烟草组织培养的快速生长和生物测定的改进培养基，《植物生理学》(Physiol.Plant)15473-497；1962)中，该培养基补充有维生素例如维生素B1-HCl(0.05-2.0mg/l)、维生素B6-HCl(0.25-1.5mg/ml)和烟酸(0.25-1.5mg/l)与甘氨酸(1.0-3.0mg/l)、以及最重要的2，4-二氯苯氧乙酸(5.0-10mg/l)，将其在同样的培养皿中在冷荧光(52μmolm-2s-1)下于25±2℃培养10-16周，然后在同样培养基中进行生根和最终的未定形幼芽形成。
ii)10-16周后切除从上述步骤得到的幼芽，并令其在含3％蔗糖和5μM苯基噻二唑基脲的20ml静态液体培养基中繁殖(SandalI.，Bhattacharya A.和Ahuja P.S.2001.用于茶树幼芽繁殖的高效液体培养系统，植物细胞组织器官培养00.1-6)。
iii)使微幼芽生根，即通过用5.0mg/l的吲哚-3-丁酸处理切除的末端，并在实验室培养条件下将其种在覆盖有倒转广口瓶的罐中的1∶1沙∶土无菌混合物中8周，然后在室温下将生根的幼芽转移至塑料罐中(Sandal I.，Bhattacharya A.和Ahuja P.S.2001.用于茶树幼芽繁殖的高效液体培养系统，植物细胞组织器官培养00.1-6)。
培养基中存在高浓度的2，4-二氯苯氧乙酸可诱导活性细胞分裂和未分化生长、导致植物组织中的愈伤组织形成。培养基中有特定浓度的2，4-二氯苯氧乙酸时的愈伤组织形成可能是由于细胞内2，4-D水平吸收增加引起的。但是当愈伤组织在培养基中停留延长一段时期(即10-16周)，在培养基中和细胞内的2，4-二氯苯氧乙酸水平有进行性稀释，导致连续的愈伤组织生长。这样减少了培养基中和细胞内的2，4-二氯苯氧乙酸水平以及培养基中的营养部分减少，可能导致应急性情形、因而导致形态发生或大量根形成。而且，由于培养基的变干和减少而致的培养基中的2，4-二氯苯氧乙酸和营养水平的减少可能导致幼芽形成和同时的愈伤组织变干。通过随愈伤组织生长或根生长的任一形式的经过时间和培养基的逐渐减少而进行性消退的2，4-二氯苯氧乙酸，可能获得形态发生每一步中的2，4-二氯苯氧乙酸水平的临界阈值。当在2，4-D减少的培养基中出现足够的根生长和连续愈伤组织生长时，开始出现幼芽。因此，由于培养基减少而至的每一步形态发生中的2，4-二氯苯氧乙酸的细胞内阈值、其消退和应急性情形对于通过去分化指导叶组织进行再生过程可能是必需的。
避免了上述缺点的本方法的新特点如下(i)本方法包括从叶外植体生产茶幼芽的单一步骤；(ii)叶外植体反应的百分比高(几乎100％)；(iii)发现选自成熟的茶树(间接体外和体外两者)的叶外植体反应效率高；(iv)该方法对于选择性/优良克隆的克隆繁殖非常有效；(v)该方法也可用于来源于树苗的叶外植体；(vi)该方法对折叠的和未折叠的叶子均有效；(vii)该方法对任何栽培品种(Chinary、Assamica和Cambod)的叶外植体均有效；(viii)该方法涉及从所有表面发育的愈伤组织形成、而不局限于在体细胞胚胎情况下叶表面的特殊区域；(ix)本方法能产生10-15％以上无定形幼芽形成、而后它可生根发育成健壮植物；(x)本发明首次报道了在叶外植体上发展最高频率的茶幼芽愈伤组织形成的“一步”法。这是与以前未能通过未定形幼芽、甚至采用许多步骤从叶外植体获得植物的所有以前的报道相对比的结果；(xi)与Kato(1996)建议的方法相比，本方法提供了生产较高频率基因转化茶树的潜在能力。这是因为与由于特定区域诱导而致的低频率的基因转化体细胞胚胎相比，该方法为单个细胞提供了可能性，即将该细胞进行基因转化以具有极大的繁殖机会、并产生成功的转化体。
图1表示在叶外植体上的愈伤组织的诱导和繁殖；图2表示来源于叶外植体的所有愈伤组织的生根(生根表示未定形生长途径转变至形态发生途径的转变点)；图3表示在叶愈伤组织上形成的根的未定形幼芽的形成；图4表示从叶外植体间接发育的生根微体幼芽。
下面的实施例是为了举例说明，因此不应将其视为对本发明范围的限定。
实施例1当在25±2℃和52μmolm-2s-1冷荧光16小时光照下将其置于补充有维生素如维生素B1-HCl(0.05-2.0mg/l)、维生素B6-HCl(0.25-1.5mg/ml)和烟酸(0.25-1.5mg/l)与甘氨酸(1.0-3.0mg/l)和2.5-10mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸(pH 5.6±0.2)的(0.8-1.0％)琼脂固化基本Murashige和Skoog培养基(Murashige T.和Skoog F.A用于烟草组织培养的快速生长和生物测定的改进培养基，《植物生理学》(Physiol.Plant)15473-497；1962)中10-16周时，任何重要栽培品种(Chinary、Assamica和Cambod)的体外培养植物的完全折叠的、半开放的或全张开的叶植物的叶都是反应性外植体。培养开始后1-2周愈伤组织在补充有维生素如维生素B1-HCl(0.05-2.0mg/l)、维生素B6-HCl(0.25-1.5mg/ml)和烟酸(0.25-1.5mg/l)与甘氨酸(1.0-3.0mg/l)和2，4-二氯苯氧乙酸(5.0-10mg/l)的基本Murashige和Skoog培养基(Murashige T.和Skoog F.A，用于烟草组织培养的快速生长和生物测定的改进培养基，《植物生理学》(Physiol.Plant)15473-497；1962)中发育，然后在同样但变干且减少的培养基中4-6周后生根、又4-6周后幼芽形成。将如此形成的幼芽转移至含液体培养基的繁殖培养基中，该培养基补充有5μm苯基噻二唑基脲(Sandal I.，Bhattacharya A.和Ahuja P.S.2001。用于茶树幼芽繁殖的高效液体培养系统，植物细胞组织器官培养00.1-6)，用吲哚-3-丁酸处理至少3.0cm长幼芽的切除末端20-30分钟、并转移至覆盖有广口瓶的无菌沙土混合物(1∶1)中至少60-75天，然后转移至开放的塑料罐中。
实施例2用来自Himalayan生物资源技术实验农场研究所，Banuri，Palampur(36°N和78.18°E和1290m以上的海平面)的任何重要栽培品种(Chinary、Assamica和Cambod)的50年龄选择性植物的完全折叠的、半开放的或全张开的叶外植体(从幼芽尖端的第二和第三叶)的叶作为外植体。用黑貂毛制成的毛刷和液体清洁剂彻底清洗该叶子，在含(0.1％)多菌灵和(0.05％)链霉素的吐温20中洗涤并在含一滴液体清洁剂的0.01％氯化汞溶液中进行表面灭菌、然后在蒸馏水中彻底清洗。将灭菌后的外植体按上面所述方法中的每个细节进行类似培养。
实施例3在25±2℃温度下和52μmolm-2s-1冷荧光16小时光照下将其它杂交栽培品种的体外培养植物的完全折叠的、半开放的或全张开的叶外植体的叶置于补充有维生素如维生素B1-HCl(0.05-2.0mg/l)、维生素B6-HCl(0.25-1.5mg/ml)和烟酸(0.25-1.5mg/l)与甘氨酸(1.0-3.0mg/l)和2.5-10mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸(pH 5.6±0.2)的(0.8-1.0％)琼脂固化基本Murashige和Skoog培养基(Murashige T.和Skoog F.A，用于烟草组织培养的快速生长和生物测定的改进培养基，《植物生理学》(Physiol.Plant)15473-497；1962)中以发育愈伤组织，1-2周后，在同样的培养基中4-6周后生根、又4-6周后幼芽形成。将如此形成的幼芽转移至含液体培养基的繁殖培养基中繁殖，该培养基补充有5μm苯基噻二唑基脲(Sandal I.，Bhattacharya A.和Ahuja P.S.2001，用于茶树幼芽繁殖的高效液体培养系统，植物细胞组织器官培养00.1-6)，为了生根，用吲哚-3-丁酸处理至少3.0cm长幼芽的切除末端20-30分钟、并转移至覆盖有广口瓶的无菌沙土混合物(1∶1)中至少60-75天，然后转移至开放的塑料罐中(Sandal I.，Bhattacharya A.和Ahuja P.S.2001，用于茶树幼芽繁殖的高效液体培养系统，植物细胞组织器官培养00.1-6)。
本发明的主要优点为(1)健壮植物可从真正同源的叶组织如叶外植体中再生；(2)本发明可用于产生抗水疱枯萎病植物；
(3)本方法也可用于原生质体培养和体细胞杂交；(4)本方法可通过直接传递法用于叶绿体转化；(5)由于与没有中间愈伤组织的叶组织的直接再生相比，愈伤组织细胞的快速繁殖期间可产生单个细胞转化体的快速繁殖，因此本方法是发展高频率转基因的最佳方法；(6)由于与以前报道中的特定区域的体细胞胚胎诱导相比，愈伤组织是从所有叶表面发育的，因此通过此方法的转化体的频率大大高于现存方法；(7)本发明可用于将有关基因引入原生质体的发育方法和用于研究其表达；(8)本发明可用于促进病毒颗粒的吸收；(9)本发明可用于产生具有诸如细胞质雄性不育的母系遗传特征、抗诸如莠去净的除草剂的植物；(10)与预先存在方法中使用50-100ml培养基相比，在可高压灭菌的陪替氏培养皿中仅使用25ml培养基是一种合算的方法；(11)由于整个过程中不需要传代培养且仅需要25ml培养基，因此本发明方法是合算的；(12)由于不需要传代培养本发明也是劳动效率高的。
权利要求
1.一种从茶树叶外植体生产微幼芽的新的一步方法，它包括约10-16周，其中(a)切除来源于用于愈伤组织诱导的体外培养的茶树植物的外植体，该外植体在补充有选自维生素B1-HCl(0.05-2.0mg/l)、维生素B6-HCl(0.25-1.5mg/ml)和烟酸(0.25-1.5mg/l)与甘氨酸(1.0-3.0mg/l)、2，4-二氯苯氧乙酸(5.0-10mg/l)的维生素的标准基本Murashige和Skoog培养基中保持2-4周，优选2周后，(b)4-6周后将愈伤组织培养物保持在用于生根或根形成的同样但部分减少了的培养基中，(c)4-6周后使生根愈伤组织在同样但几乎干燥且减少了的培养基中生根，(d)将用于繁殖的步骤(c)形成的幼芽转移至含补充有5μM苯基噻二唑基脲的液体培养基的繁殖培养基中，(e)切断长幼芽的末端至少约3.0cm，用吲哚-3-丁酸处理幼芽末端20-30分钟、将其转移并保持在含沙土混合物(1∶1)的广口瓶中至少60-75天得到小植株，(f)将小植株转移至开口的塑料罐中得到健壮的有活力的茶树。
2.如权利要求1所述的方法，其中外植体是选自Chinary、Assamica和Cambod的茶叶栽培品种。
3.如权利要求1所述的方法，其中通过诱导叶外植体中的分生组织的活性，来源于任何茶树栽培品种及其杂交体的叶外植体被用于间接幼芽形成。
4.如权利要求1所述的方法，其中通过诱导叶外植体中的分生组织的活性，来源于生长体内和体外条件下的选择性植物的任何茶树栽培品种的叶外植体被用于间接幼芽形成。
5.如权利要求1所述的方法，其中使用的是来源于任何折叠至完全展开的叶子的叶外植体。
6.如权利要求1所述的方法，其中外植体是从幼芽尖端的第二和第三叶切除的。
7.如权利要求1所述的方法，其中培养基包括标准的基本琼脂固化(0.8-1.0％)Murashige和Skoog培养基，该培养基的pH为5.8、补充有维生素例如维生素B1-HCl(0.05-2.0mg/l)、维生素B6-HCl(0.25-1.5mg/ml)和烟酸(0.25-1.5mg/l)与甘氨酸(1.0-3.0mg/l)、以及最重要的2.5-10mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸，优选10.0mg/l。
8.如权利要求1所述的方法，其中外植体被置于步骤(i)的补充有2.5-10mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸的培养基中至少10-16周，优选12周。
9.如权利要求1所述的方法，其中植物生长调节剂的茁长素选自吲哚-3-丁酸、吲哚-3-乙酸、萘乙酸和2，4-二氯苯氧乙酸。
10.如权利要求1所述的方法，其中仅一种茁长素是用于叶外植体的健壮幼芽的再生。
11.如权利要求1所述的方法，其中仅使用了可高压灭菌的9.0cm陪替氏培养皿中的25ml培养基。
12.如权利要求1所述的方法，其中不需要穿戴培养，并且本方法是简单的一步法。
13.如权利要求1所述的方法，其中在52μmolm-2s-1的冷荧光下的16小时光照期被用于所有培养物且培养基的pH为5.6-5.9。
全文摘要
本发明提供了从经愈伤组织相的叶外植体微体繁殖茶树的一步法,其中从愈伤组织的诱导阶段至生根和幼芽形成的阶段,将外植体在补充有维生素例如维生素B
文档编号C12N5/02GK1375190SQ0110982
公开日2002年10月23日 申请日期2001年3月20日 优先权日2001年3月20日
发明者因德拉·桑达尔, 阿米塔·巴塔查里亚, 马杜·夏尔马, P·S·阿胡贾 申请人:科学与工业研究委员会