专利名称：一种茶树乳酸脱氢酶基因Cam-LDH及其编码蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及茶树乳酸脱氢酶基因Cam-LDH以及该基因编码的LDH蛋白，属于 基因工程技术领域。
背景技术：
乳酸脱氢酶是以NAD+为辅酶，催化生物体内糖代谢过程中乳酸和丙酮酸之间可逆反应的一组同工酶，广泛分布在微生物、动植物细胞中，并具有组织器官特异性。LDH同时催化乳酸的脱氢反应及其逆反应，而这两步反应是NAD+和NADH循环的重要步骤，保证了糖酵解等生理过程的顺利进行。乳酸脱氢酶分别由LDHA和LDHB两种基因编码，有LDH1, LDH2, LDH3、LDH4、LDH5* 5种同工酶形式，此外在动物的睾丸和精子中还特异的存在LDHC基因编码的蛋白。同工酶是同一种或属中，由不同基因位点或等位基因编码的多肽链单体，呈纯聚体或杂聚体，它们的一级结构、理化性质及生理功能有所不同，但催化功能相同的多态性酶类。同工酶广泛存在于生物界中，现已有60多种动、植物体内的同工酶被研究报道。同工酶的特点是具有明显的种属、组织和发育阶段的特异性，既可作为生理指标，又是可靠的遗传标志。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)在厌氧条件下能够催化丙酮酸接受 NADH上的氢，生产乳酸；当动物体缺乏葡萄糖时，还可以氧化乳酸生成丙酮酸并经葡萄糖异生途径转变为葡萄糖。乳酸作为乳酸脱氢酶的产物具有重要的工业应用价值。乳酸及其盐类和衍生物可以用于食品、酿造、皮革、卷烟、化工和印染等工业。尤其近年来，利用乳酸聚合生产生物可降解塑料、绿色包装材料及农用薄膜，来解决日益严重的环境问题。
发明内容
本发明所要解决的第一个问题是提供茶树(龙井43)乳酸脱氢酶全长序列，并完成了该基因编码区的全序列分析。本发明解决上述技术问题的技术方案如下提取一种茶树(龙井43)谷氨酸脱氢酶基因Cam-LDH的总cDNA，通过设计一对上下游引物LDH-5和LDH-3进行PCR扩增，其主要特点是上游引物LDH-5，其基因型为GAAAAAAACTTAGAGAGAGAAGAAA ；下游引物LDH-3，其基因型为TCAAACACCCAACTGGTTTTGCACC ；茶树谷氨酸脱氢酶基因Cam-LDH的总cDNA的PCR扩增反应，其扩增条件为94°C 预变性3min ；95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸1. 5min，反应35个循环；72°C终止延伸 IOmin ；4°C保存。将PCR扩增之后的产物经过载体连接和液体培养基培养，并通过引物M13-47/ RV-M进行菌液PCR以验证阳性克隆，最终得到谷氨酸脱氢酶基因Cam-LDH。菌落PCR反应的条件为95°C预变性3min ；95°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸 lmin，反应35个循环；72°C终止延伸IOmin ；4°C保存。
该基因全长1300bp，包含一个ATG起始密码子和TAG终止密码子以及24bp的 PolyA尾巴，84bp长的5'非编码区和163bp长的3 ‘非编码区，编码一个含有350个氨基残基的蛋白质。本发明所要解决的第二个问题是提供以Cam-LDH基因全序列编码的苹果酸脱氢酶LDH蛋白。本发明解决上述技术问题的技术方案如下通过设计引物LDH-Fl和LDH-F2实现pET28b_LDH重组质粒的构建。其中引物 LDH-Fl 基因型为CATGCCATGGGCATGCATCATACTGAATCATCGTCGT，引物 LDH-F2 基因型为CTGTGATTCTCGAGAACACCCAACTGGTTTTGCACC，以实施例一中Cam-LDH基因全序列为模板，PCR扩增蛋白质编码区域，反应条件为:95°C预变性3min ；95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸IminlOs，反应35个循环；72°C 终止延伸IOmin ;4°C保存。PCR扩增产物经过载体双酶切和阳性克隆后获得由茶树LDH基因编码的表达质粒pET28b-LDH。将pET28b_LDH重组质粒转化至E. coli Rosetta (DE3)感受态细胞，经过液体培养基培养之后得到菌液。取Iml菌液接种于50ml的LB液体培养基中扩大培养并加入0. 5mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达；将诱导表达好的菌液离心收集菌体和超声波破碎后在沉淀中发现带有His标签的LDH蛋白(图4)。本发明的有益效果是茶树[Camellia sinensis (L. ) 0. Kuntze]属于山茶科山茶属，为多年生常绿木本植物。茶叶是世界上最流行的无酒精饮品之一，具有许多生理保健作用。在包括中国在内的许多国家，茶树是重要的木本经济作物之一。它含有许多有重要价值的次生代谢产物如黄酮类、生物碱类、多酚类化合物等，其中以多酚类化合物中的儿茶素对于人体健康效果最为突出，它不仅具有防治肿瘤的效果，而且对增强微血管强韧性，降低血糖、血脂、血压，预防肝脏及冠状动脉硬化都有明显疗效。迄今为止，尚无茶树(龙井43) 完整LDH基因克隆报告。
图ICam-LDH基因的PCR扩增M =Marker DL2000 ； 1 基因的 PCR 扩增产物图2Cam-LDH基因蛋白质编码区域的扩增M =Marker DL2000 ；1 蛋白质编码区域的PCR扩增产物图3重组质粒的双酶切检测M =Marker DL2000 ；1 双酶切的重组质粒pET28b_LDH 双酶切的后的LDH ；3 双酶切后的pET28b质粒图4pET28b_LDH的蛋白质电泳图
具体实施例方式以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例一茶叶总RNA的提取与cDNA的获得。
采用植物总RNA纯化试剂盒(MACHEREY-NAGEL公司)提取茶树(龙井43)总RNA， 将提取出的茶树总RNA采用Reverse Transcription System试剂盒(Promega公司)获得总cDNA，并将总cDNA于_20°C保存。实施例二 乳酸脱氢酶全序列的获得。设计上下游引物LDH-5和LDH-3 LDH-5 序列GAAAAAAACTTAGAGAGAGAAGAAA，LDH-3 序列TCAAACACCCAACTGGTTTTGCACC，以茶树总cDNA为模板，PCR扩增，PCR反应程序为95°C，3min预变性；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin30s反应35个循环；72°C延伸IOmin ；4°C保存。1 %琼脂糖凝胶电泳分离 PCR产物，AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)回收PCR产物，连接到pMD19_T载体 (TaKaRa公司生产)上，16°C连接过夜，把连接液转移到大肠杆菌E. coli DH5a感受态细胞中，倒LB固体培养基(含Amp)并在其表面均勻涂布40 μ 15-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷和7 μ 1异丙基-β -D-硫代半乳糖苷，12h培养后，挑取白斑，将白斑放在LB (含Amp) 液体培养基中培养，用PMD19-T载体试剂中的引物M13-47/RV-M，进行菌液PCR(菌落PCR条件为95°C，3min 预变性；95°C 30s, 55°C 45s, 72°C Imin 反应 35 个循环；72°C 延伸 IOmin ； 4°C保存)验证阳性克隆，得到Cam-LDH基因，送交上海英骏生物技术有限公司测序。序列分析该基因全长1300bp，包含一个ATG起始密码子和TAG终止密码子以及24bp的 PolyA尾巴，84bp长的5'非编码区和163bp长的3 ‘非编码区，编码一个含有350个氨基残基的蛋白质。用 Protparam (http //au. expasy. org/tools/protparam. html)预SllJ茶丰对 LDH 蛋白的理化性质，推测该蛋白分子式为C1688H2713N4670506S5，相对分子质量为37. 806kD, 等电点PI为6. 37 ；理论推导半衰期大约为30h，不稳定参数为35. 98，属于稳定蛋白(超过40认为蛋白质不稳定)。该蛋白中含量比较多的氨基酸是Leu(39个，11. )、Ala(32 个，9. )、Ser (32个，9. 1 ，该蛋白中含量比较少的氨基酸是Met (4个，1. 1% ),Trp(3 个，0.9% )、Cys(l个，0.3% )。总的带负电荷的残基(Asp+Glu)为34，带正电荷的残基 (Arg+Lys)为 31。脂肪指数(Aliphatic index)为 106. 97。亲水性平均数(GRAVY)为 0. 057， 预测该蛋白质为疏水性蛋白质。实施例三1、pET28b-LDH重组质粒的构建设计引物LDH-Fl :CATGCCATGGGCATGCATCATACTGAATCATCGTCGT ；LDH-F2 CTGTGATTCTCGAGAACACCCAACTGGTTTTGCACC,下划线分别为 Nco I 和 Xho I 酶切位点。以实施例1中Cam-LDH基因全序列为模板，PCR扩增蛋白质编码区域，反应条件为95°C，3min 预变性；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C IminlOs 反应 35 个循环；72°C延伸 IOmin ； 4°C保存。扩增产物(图2)与载体pET28b采用Nco I和Xho I双酶切4小时候，连接，转化至E. coli DH5 α感受态细胞，倒LB平板，筛选阳性克隆，获得表达质粒pET28b_LDH。采用Nco I和Xho I双酶切鉴定后(图3)，送交上海英骏生物技术有限公司测序，序列比对发现实施例1结果一致，扩增的序列确为茶树LDH编码基因。
2、乳酸脱氢酶蛋白的诱导表达将pET28b_LDH重组质粒转化至E. coli Rosetta (DE3)感受态细胞，挑取单克隆于含5 ml LB液体培养基的试管中，37°C，225rpm，培养12小时，得到菌液。取Iml菌液接种于50ml的LB液体培养基中扩大培养，37°C，225rpm,振荡培养至 0D600为0. 4-1. O时(最好0. 6)；加入0. 5mM异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，20°C诱导表达16h ；将诱导表达好的菌液于4°C，5，OOOrpm,离心5min，收集菌体，超声波破碎，在沉淀中发现带有His标签的LDH蛋白(图4)。
权利要求
1.一种茶树乳酸脱氢酶新基因Cam-LDH及其编码的苹果酸脱氢酶LDH蛋白，其特征在于，该基因全长1300bp，包含一个ATG起始密码子和TAG终止密码子以及24bp的polyA尾巴，84bp长的5'非编码区和163bp长的3'非编码区，编码一个含有350个氨基残基的蛋白质。
2.如权利要求1所述的茶树乳酸脱氢酶新基因Cam-LDH及其编码的苹果酸脱氢酶LDH 蛋白，其特征在于，所述茶树乳酸脱氢酶新基因Cam-LDH是PCR扩增之后的产物经过载体连接和液体培养基培养，并通过引物M13-47/RV-M进行菌液PCR以验证阳性克隆所获得。
3.如权利要求2所述的茶树乳酸脱氢酶新基因Cam-LDH及其编码的苹果酸脱氢酶LDH 蛋白，其特征在于，所述PCR扩增通过设计一对上下游引物LDH-5和LDH-3进行PCR扩增， 其扩增条件为94°C预变性3min ；95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸1. 5min，反应35个循环；72°C终止延伸IOmin ；4°C保存。
4.如权利要求2所述的茶树乳酸脱氢酶新基因Cam-LDH及其编码的苹果酸脱氢酶LDH 蛋白，其特征在于，所述菌落PCR反应的条件为95°C预变性3min ；95°C变性30s，55°C退火 45s，72°C延伸lmin，反应35个循环；72°C终止延伸IOmin ；4°C保存。
5.如权利要求3所述的茶树乳酸脱氢酶新基因Cam-LDH及其编码的苹果酸脱氢酶LDH 蛋白，其特征在于，上游引物 LDH-5，其基因型为GAAAAAAACTTAGAGAGAGAAGAAA ；下游引物 LDH-3，其基因型为TCAAACACCCAACTGGTTTTGCACC ；
6.如权利要求1所述的由茶树乳酸脱氢酶新基因Cam-LDH编码的苹果酸脱氢酶LDH蛋白，其特征在于，该蛋白由茶树LDH基因编码的表达质粒pET28b-LDH经过液体培养基培养之后得到菌液，再经过扩大培养并诱导表达；将诱导表达好的菌液离心收集菌体和超声波破碎后在沉淀中获得。
7.如权利要求6所述的茶树乳酸脱氢酶新基因Cam-LDH及其编码的苹果酸脱氢酶LDH 蛋白，其特征在于，所述蛋白由茶树LDH基因编码的表达质粒pET28b-LDH通过设计引物 LDH-Fl和LDH-F2以Cam-LDH基因全序列为模板，PCR扩增蛋白质编码区域，PCR扩增产物经过载体双酶切和阳性克隆后获得。
8.如权利要求7所述的茶树乳酸脱氢酶新基因Cam-LDH及其编码的苹果酸脱氢酶LDH 蛋白，其特征在于，引物 LDH-Fl 基因型为CATGCCATGGGCATGCATCATACTGAATCATCGTCGT，引物 LDH-F2 基因型为CTGTGATTCTCGAGAACACCCAACTGGTTTTGCACC，
9.如权利要求7所述的茶树乳酸脱氢酶新基因Cam-LDH及其编码的苹果酸脱氢酶LDH 蛋白，其特征在于，所述PCR扩增反应条件为95 0C预变性3min ；95 °C变性30s，55 °C退火 30s，72°C延伸IminlOs，反应35个循环；72°C终止延伸IOmin ；4°C保存。
全文摘要
本发明涉及一种来自于茶树乳酸脱氢酶新基因Cam-LDH(GenBank登录号为HM114228)，表达蛋白为乳酸脱氢酶。本发明过程主要包括以下步骤(1)该基因保守区域的获得设计简并性引物，从茶树中扩增出中间保守片段；(2)RACE扩增两端区域利用巢式PCR，根据已经获得的保守片段的序列，扩增获得两端序列；(3)全序列拼接；(4)全序列分析该基因共1300bp，编码产生一个350个氨基酸的蛋白质。本发明的目的是为乳酸脱氢酶的生物学研究以及其催化产物乳酸的工业应用提供服务。
文档编号C12N15/63GK102311962SQ201010220658
公开日2012年1月11日 申请日期2010年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者宣守芹, 曹正宇, 朱国萍, 王宝娟, 王晖, 王鹏, 翟羽佳, 陈露露 申请人:安徽师范大学