专利名称：茶树外植体无汞消毒剂及外植体消毒方法
技术领域：
本发明涉及茶树外植体无汞消毒剂及外植体消毒方法，属于茶树组织培养技术领域。
背景技术：
茶树属山茶科山茶属多年生常绿木本植物。其叶的加工饮品是世界上三大无酒精饮料之一。由于茶树基因的高度杂合性，传统的育种方法在改良茶树品种方面难度较大，而利用组培进行茶树繁殖不仅可大大提高繁殖系数，而且能最大限度地保持品种的遗传稳定性，对新品种和良种茶树快速推广有重要价值，同时还可以通过水培、无土栽培来工厂化生产茶叶。但是，污染是植物组织培养过程中的难题之一，特别是像茶树这样的木本植物，由于含有多种内生菌，组织培养时污染尤为严重。目前，组织培养常用的消毒剂有Ca(C10)2(0. 5% -10% ), HgCl2 (0. 1 % _1 % )、 CH3CH2OH(70%-75%)、H202 (3%-10%)、漂白粉(饱和溶液)等。0. 1 % HgCl2 是应用最广泛的一种消毒剂，但其有剧毒，且消毒后难以除去残余的汞，对外植体有杀伤作用，还会进入外植体组织内部，在增殖过程中一代传给一代。CH3CH2OH虽能渗入外植体内杀死病菌，但其对植物组织具有相当的破坏性，所以，消毒时间不易太长，但时间过短不易达到好的消毒效果。目前，茶树组织培养中的外植体主要采用的表面消毒方法是使用CH3CH20H(70% -75% ) 和升汞(0. l%-0. 2% )组合消毒。但是只要用了升汞，外植体中就可能有残留，通过组培手段得到的茶叶就可能含有汞，若将其作为饮品就有潜在的危险性，可能会对人的身体健康和生命安全带来危害。但由于茶树内生菌较多，目前的报道都是采用HgCl2才能较为全面的对茶树外植体进行消毒，因此，研究一种无汞的茶树组培消毒剂及消毒方法成为本领域目前迫切需要解决的技术难题。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种茶树外植体无汞消毒剂，该消毒剂能较为全面的对茶树外植体进行消毒。本发明茶树外植体无汞消毒剂包括包装在空间独立的单元中的顺序给药的溶液A 和溶液B，所述的溶液A为70 SOwt %的乙醇溶液，所述的溶液B为次氯酸钠和吐温的混合溶液，其含有5 IOwt%的次氯酸钠和0. 05 0. 15wt%吐温。进一步的，为了提高消毒效果，上述的溶液A优选为75wt%的乙醇溶液，上述的溶液B中优选含有5wt%的次氯酸钠和0. Iwt %吐温。其中，本发明中的吐温可以为常用的吐温，如吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80中至少一种，所述的吐温优选为吐温-20。本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种茶树外植体消毒方法，该方法能较为全面的对茶树外植体进行无汞消毒。本发明茶树外植体消毒方法，包括外植体的清洗、外植体的防褐化处理和外植体的消毒步骤，其中，外植体消毒时，先用上述消毒剂中的溶液A浸泡25 35s，再将外植体浸入消毒剂的溶液B中，并用功率100 140W的超声波震荡5 12min，然后用灭菌水清洗外植体。进一步的，为了提高消毒效果，本发明茶树外植体消毒方法，外植体消毒时，优选先用上述的消毒剂的溶液A浸泡30s，再将外植体浸入消毒剂的溶液B中，并用功率120W的超声波震荡lOmin。其中，本发明茶树外植体消毒方法，其外植体的清洗和外植体的防褐化处理都可以采用常规方法，优选采用下述方法对茶树外植体进行防褐化处理将洗净的外植体放入含有20mg/L氨卞和5mg/L抗坏血酸的溶液里浸泡20min。其中，本发明茶树外植体消毒方法，所述的外植体可以取自茶树的任何组织，如 取自茶树的芽、茎或叶。为了利于组织培养，所述的外植体优选取自茶树的带腋芽茎段。其中，本发明茶树外植体消毒方法适合于常见的茶树，如适制绿茶茶树、适制红茶茶树或适制乌龙茶茶树等。本发明可以对茶树外植体进行无汞消毒，其消毒效果达到甚至超过了升汞的消毒效果，其成本低，使通过组织培养手段得到的茶叶可成为生态安全的茶叶。本发明为茶树外植体的无汞消毒提供了一种新的选择，具有广阔的应用前景。
具体实施例方式本发明茶树外植体无汞消毒剂包括包装在空间独立的单元中的顺序给药的溶液A 和溶液B，所述的溶液A为70 SOwt %的乙醇溶液，所述的溶液B为次氯酸钠和吐温的混合溶液，其含有5 IOwt%的次氯酸钠和0. 05 0. 15wt%吐温。进一步的，为了提高消毒效果，上述的溶液A优选为75wt%的乙醇溶液，上述的溶液B优选含有5wt%的次氯酸钠和0. Iwt %吐温。其中，本发明中的吐温可以为常用的吐温，如吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80中至少一种，所述的吐温优选为吐温-20。本发明还提供了一种茶树外植体消毒方法，该方法能较为全面的对茶树外植体进行无汞消毒。本发明茶树外植体消毒方法，包括外植体的清洗、外植体的防褐化处理和外植体的消毒步骤，其中，外植体消毒时，先用上述消毒剂中的溶液A浸泡25 35s，再将外植体浸入消毒剂的溶液B中，并用功率100 140W的超声波震荡5 12min，然后用灭菌水清洗外植体。进一步的，为了提高消毒效果，本发明茶树外植体消毒方法，外植体消毒时，优选先用上述的消毒剂的溶液A浸泡30s，再将外植体浸入消毒剂的溶液B中，并用功率120W的超声波震荡lOmin。其中，本发明茶树外植体消毒方法，其外植体的清洗和外植体的防褐化处理都可以采用常规方法，优选采用下述方法对茶树外植体进行防褐化处理将洗净的外植体放入含有20mg/L氨卞和5mg/L抗坏血酸的溶液里浸泡20min。其中，本发明茶树外植体消毒方法，所述的外植体可以取自茶树的任何组织，如 取自茶树的芽、茎或叶。为了利于组织培养，所述的外植体优选取自茶树的带腋芽茎段。
其中，本发明茶树外植体消毒方法适合于常见的茶树，如适制绿茶茶树、适制红茶茶树或适制乌龙茶茶树等。下面结合实施例对本发明的具体实施方式
做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。实施例1采用下述方法对茶树外植体进行消毒处理a、外植体准备剪取3月份适制绿茶(福鼎大白)新鲜的一芽三、四叶新稍，将第二、三、四腋芽剪成1 1. 5cm茎段；b、外植体的清洗用流水冲洗外植体半个小时，冲洗后用含有洗洁精的溶液浸泡lOmin，其间不停地搅拌，再依次用清水、灭菌水清洗多次；C、防止外植体褐化将洗净的外植体放入含有终浓度为20mg/L氨卞和5mg/L抗坏血酸的溶液里浸泡20min ；d、外植体的消毒将c步骤所得的外植体用70wt%乙醇溶液浸泡35s，再将其用表 1中的消毒方法消毒，然后用灭菌的纯水清洗超声后的外植体5次。将消毒后的外植体接种于相同的培养基(茶树组织培养的常规培养基，下同)中， 置于相同的条件下培养。每两天调查记录1次材料污染情况，经过1个月的培养后统计接种材料的染菌率和褐化率。结果如表1所示。表 权利要求
1.茶树外植体无汞消毒剂，其特征在于包括包装在空间独立的单元中的顺序给药的溶液A和溶液B，所述的溶液A为70 80wt%的乙醇溶液，所述的溶液B为次氯酸钠和吐温的混合溶液，其含有5 IOwt%的次氯酸钠和0. 05 0. 15wt%吐温。
2.根据权利要求1所述的茶树外植体无汞消毒剂，其特征在于所述的溶液A为 75wt%的乙醇溶液，所述的溶液B中含有5wt%的次氯酸钠和0. Iwt%吐温。
3.根据权利要求1或2所述的茶树外植体无汞消毒剂，其特征在于所述的吐温为吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80中至少一种。
4.根据权利要求3所述的茶树外植体无汞消毒剂，其特征在于所述的吐温为吐温—20 ο
5.茶树外植体消毒方法，包括外植体的清洗、外植体的防褐化处理和外植体的消毒步骤，其特征在于外植体消毒时，先用权利要求1或2中的消毒剂的溶液A浸泡25 35s， 再将外植体浸入消毒剂的溶液B中，并用功率100 140W的超声波震荡5 12min，然后用灭菌水清洗外植体。
6.根据权利要求5所述的茶树外植体消毒方法，其特征在于外植体消毒时，先用权利要求1或2中的消毒剂的溶液A浸泡30s，再将外植体浸入消毒剂的溶液B中，并用功率 120W的超声波震荡lOmin。
7.根据权利要求5或6所述的茶树外植体消毒方法，其特征在于采用下述方法对茶树外植体进行防褐化处理将洗净的外植体放入含有20mg/L氨卞和5mg/L抗坏血酸的溶液里浸泡20min。
8.根据权利要求5 7任一项所述的茶树外植体消毒方法，其特征在于所述的外植体取自茶树的芽、茎或叶。
9.根据权利要求8所述的茶树外植体消毒方法，其特征在于所述的外植体取自茶树的带腋芽茎段。
10.根据权利要求5 9任一项所述的茶树外植体消毒方法，其特征在于所述的茶树为适制绿茶茶树、适制红茶茶树或适制乌龙茶茶树。
全文摘要
本发明涉及茶树外植体无汞消毒剂及外植体消毒方法，属于茶树组织培养技术领域。本发明所解决的技术问题是提供了一种茶树外植体无汞消毒剂及外植体消毒方法，其能较为全面的对茶树外植体进行无汞消毒。本发明茶树外植体无汞消毒剂，包括包装在空间独立的单元中的顺序给药的溶液A和溶液B，所述的溶液A为70～80wt％的乙醇溶液，所述的溶液B为5～10wt％的次氯酸钠和0.05～0.15wt％吐温的混合溶液。
文档编号A01H4/00GK102326514SQ20111033965
公开日2012年1月25日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者叶德萍, 唐祥凯, 沈兴中, 王智, 谭和平 申请人:四川中测科技投资有限公司